IL1β、幽门螺杆菌cagA与人慢性胃炎的关系

　　作者：乔文1，李 娜2，李长顺1，薛 挥1 作者单位：(1. 西安交通大学医学院第一附属医院消化科，陕西西安 710061;2. 兵器工业部521医院消化科，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨IL1β、幽门螺杆菌cagA基因(cytotoxin A)和人慢性胃炎之间的相关性。方法 收集西安交通大学医学院第一附属医院胃镜检查的胃活检标本，经甲醛固定，制备石蜡切片，进行病理分型和IL1β SABC免疫组化染色;同时作幽门螺杆菌培养，16s rRNA PCR鉴定，检测cagA基因。结果 慢性萎缩性胃炎组IL1β表达的阳性率高于慢性浅表性胃炎组(P<0.05);慢性萎缩性胃炎组中，异型增生组IL1β表达的阳性率高于肠腺化生组(P<0.05)。幽门螺杆菌cagA基因阳性率在慢性萎缩性胃炎组和慢性浅表性胃炎组无显著性差异(P>0.05)，异型增生组cagA基因阳性率和肠腺化生组亦无显著性差异(P>0.05)。结论 IL1β在慢性胃炎的转归和发展中具有比cagA基因更高的预测价值。

　　【关键词】 IL1β;幽门螺杆菌;cagA基因;慢性胃炎

　　Correlation between IL1β, cagA of Helicobacter pylori

　　and chronic gastritisQIAO Wen1, LI Na2, LI Changshun1, XUE Hui1

　　(1. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Gastroenterology,

　　No.521 Hospital, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To discuss the correlation between IL1β, cagA of Helicobacter Pylori and chronic gastritis. Methods We collected the gastric biopsy specimens by gastroscopy for pathologic examination and culture of Helicobacter pylori. In the meantime, IL1β was detected by SABC histoimmunology and cagA gene was tested by polymerase chain reaction. Results The positive rate of IL1β in chronic atrophic gastritis group was higher than that in chronic superficial gastritis group (P<0.05). In the chronic atrophic gastritis group, the positive rate of IL1β in dysplasia group was higher than that in intestinal mesplasia group (P<0.05). There was no obvious difference in the positive rate of cagA gene between chronic atrophic gastritis group and chronic superficial gastritis (P>0.05). There was no obvious difference in the positive rate of IL1β between dysplasia group and intestinal mesplasia group (P>0.05). Conclusion IL1β has a higher value than cagA gene in predicting the prognosis of chronic gastritis.

　　KEY WORDS: interleukin1β; Helicobacter pylori; cagA; chronic gastritis

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种革兰氏阴性染色菌，寄居于人的胃黏膜中。在环境因素中，Hp感染是引起胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要因素[1]。目前世界上有半数以上的人被Hp感染，但其中大多数为无症状感染者，只有极少数发展成胃癌，因此目前认为可能既存在Hp感染的因素，也有宿主本身的因素。在Hp致病机制中[2]，其分泌的毒力因子细胞毒素相关基因(cytotoxin associated gene A, cagA)所编码的cagA毒素是Hp重要的毒力因子之一，cagA蛋白的表达有赖于cagA基因的存在。IL1β可抑制胃酸分泌，持续的低酸分泌可发展成为胃萎缩，增加了宿主胃癌发生的危险性[3]。本研究旨在探讨宿主IL1β、幽门螺杆菌cagA基因和慢性胃炎之间的相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本来源 200例胃黏膜标本均取自西安交通大学医学院第一附属医院胃镜室接受胃镜检查的患者。取材部位距幽门口3～5cm处的胃窦小弯侧黏膜4块，分别送病理制备石蜡切片和置于0.5mL布氏培养液中用于细菌分离培养。排除标准：有外科手术史;感染HBsAg、HIV病毒;有活动性胃肠出血;在接受胃镜检查前1月内服用激素或其他免疫抑制剂、抗体及质子泵抑制剂。经病理证实为慢性浅表性胃炎64例，慢性萎缩性胃炎136例，其中肠上皮化生75例、异型增生61例。

　　1.1.2 主要实验材料 哥伦比亚琼脂培养基和布氏肉汤粉购自上海卫生防疫站。Hp cagA和16s rRNA primer由上海生物工程技术公司合成，primer序列见cagA。primer1：5′ATAATGCTAAATTAGACAACT

　　TGAGCGA3′，primer 2：5′TTAGAATAATCAACA

　　AACATCACGCCAT3′;16s rRNA：primer 1：5′TGG

　　CAATCAGCGTCAGGTAATG3′，primer 2：5′GCT

　　AAGAGATCAGCCTATGTCC3′。白介素1β多克隆抗体由Santa Cruz Biotechnology公司提供。SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Taq DNA聚合酶购自西安鼎国有限公司。标准菌株8823、60190由英国ATHERTON JC博士惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 幽门螺杆菌的培养及鉴定 将所取组织在含有4mL生理盐水的无菌匀浆器中研磨成匀浆，分别吸取0.5mL接种于哥伦比亚琼脂培养基，然后用接种环将其均匀划开，放入厌氧培养箱中，抽气换气1次。在微需氧条件下，37℃培养5d。取1接种环幽门螺杆菌 ，生理盐水稀释后，涂于载玻片上，常规Gram染色，完成初步鉴定。

　　1.2.2 模板DNA的制备 刮去培养基平板上的可疑菌落，将其溶于500μL生理盐水中，-30℃冷冻20min，取出置于室温15min，完全溶解，混匀后，再放入冰箱。如此反复冻融3次后，4℃ 12000r/min离心15min，吸取上清液，-20℃保存备用。

　　1.2.3 16srRNA基因PCR PCR反应总体积25μL。PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(250μmol/L)2.5μL，primer1(25μmol/L)0.75μL，primer2(25μmol/L)0.75μL，模板3μL，Taq DNA聚合酶(5u/mL)0.5μL，去离子水12μL，MgCl2 3μL。反应条件：95℃ 变性5min→(94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min)×30个循环→72℃ 7min→4℃保存。15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

　　1.2.4 cagA基因PCR PCR反应总体积25μL。PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，4dNTP(250μmol/L) 0.5μL，primer 1(25μmol/L)0.75μL，primer 2(25μmol/L)0.75μL，模板5μL，Taq DNA聚合酶(5u/mL)0.5μL，去离子水15μL。反应条件：94℃ 变性5min→(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min)×30个循环→72℃ 5min→4℃保存。20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

　　1.2.5 胃黏膜的组织病理学诊断 两位病理医师盲法阅片。常规HE染色法，根据国际胃肠病的病理学诊断标准确定胃黏膜活检标本的病理分型。

　　1.2.6 IL1β免疫组织化学染色 对幽门螺杆菌培养阳性者的组织切片进行免疫组化染色。常规脱蜡至水，每张切片加10g/L Triton X100工作液50μL、37℃ 1h进行抗原修复。加50g/L BSA封闭液，室温20min。加1∶30稀释的一抗兔IgG，4℃过夜，PBS洗涤2min×3次。加生物素化羊抗小兔IgG，37℃ 1h，PBS洗涤2min×3次。加SABC 37℃ 40min，PBS洗涤5min×4次。DAB显色。苏木素复染，脱水、透明、封片和显微镜下观察。

　　1.2.7 统计学分析 采用SPSS10.0统计学软件。cagA基因与慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型性增生与慢性浅表性胃炎的关系采用χ2检验;IL1β免疫组织化学染色与慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型性增生与慢性浅表性胃炎的关系采用χ2检验，肠上皮化生和不典型性增生的关系采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 幽门螺杆菌的培养和鉴定 幽门螺杆菌呈透明、针尖样大小状。Hp涂片Gram染色镜检呈弧形、S形、海鸥状弯曲菌或短杆菌。16srRNA基因PCR产物为一条522bp的清晰电泳条带(图1)。200例标本中幽门螺杆菌菌株分离数为：慢性浅表性胃炎32例，慢性萎缩性胃炎85例，其中肠上皮化生47例，非典型增生38例，合计分离菌株数117例。

　　2.2 cagA基因PCR分析 117株临床分离的Hp中93株为cagA基因阳性(图2)，阳性率79.5%。其中25例慢性浅表性胃炎，68例慢性萎缩性胃炎，其中肠上皮化生37例、异型增生31例(表1)。经χ2检验，慢性萎缩性胃炎组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.19;肠腺化生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.22;异型增生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.22，均无显著性差异。

　　2.3 IL1β免疫组织化学染色 IL1β蛋白主要定位于胃黏膜细胞质中，呈棕黄色颗粒(图3)。随机计数5个高倍视野，计算阳性细胞百分率，≥30%为阳性，<30%为阴性。染色强度判定：浅黄色为弱阳性(-)，棕色为阳性(+)，棕褐色为强阳性()。IL1β在不同胃黏膜病变组织中的表达见表2。经χ2检验，慢性萎缩性胃炎组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.00;肠腺化生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.02;异型增生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.00;肠腺化生组与异型增生组比较，P=0.01。均有显著性差异。表2 IL1β在不同胃炎组中的表达

　　3 讨 论

　　幽门螺杆菌与胃炎、消化性溃疡及胃癌等许多疾病的发生有关。世界卫生组织国际癌症研究机构在1994年年鉴中已将其列为人类胃癌的第一致癌原[4]。然而世界上约有半数人口感染了Hp，但不同个体感染Hp的后果差异很大，有的为无症状的携带者，有的发生消化性溃疡，而部分患者可发生胃癌，其中的机制尚不清楚。宿主因素、幽门螺杆菌毒力型在发病中是否起很大的作用，是目前研究的重点。

　　幽门螺杆菌是一种微需氧的革兰氏阴性菌，培养需要较高的条件，因此培养的阳性率相对较低，本研究培养阳性率仅为58.5%。CagA蛋白是由cagA基因编码的一种分子质量为120～140ku的具有强免疫原性的外膜蛋白。CagA的功能尚未完全明确。胃癌的发生是一个多阶段、多因素的过程。肠上皮化生和非典型增生可能是幽门螺杆菌感染起主要作用的起始阶段。肠上皮化生是胃上皮类似于肠上皮的形态学改变，是胃黏膜对持续性感染的一种适应。CRAANEN[5]报道在135例肠化生的的胃窦黏膜中Hp阳性有95例(72.6%)。胃黏膜上皮异型增生是重要的癌前病变。陈孝等[6]用PCR法检测胃黏膜幽门螺杆菌的研究结果显示，存在胃黏膜异型增生组的幽门螺杆菌检出率为89.5%。本研究显示在幽门螺杆菌阳性的慢性浅表性胃炎、肠上皮化生和异型增生组中cagA基因的表达无显著差异，所以cagA基因还不能作为慢性胃炎转归、恶变的预测指标。

　　白细胞介素1(interleukin1, IL1)是机体对幽门螺旋杆菌的免疫炎性反应中最关键的功能细胞因子。在胃炎、胃溃疡时，胃黏膜上皮细胞具有较高的IL1β mRNA表达率，显示IL1β参与了胃黏膜炎症，上调IL8表达。在生理条件下，IL1β具有调控几种类型胃上皮细胞的功能，这些细胞包括分泌激素来调节胃酸分泌的细胞和壁细胞，是目前已知最强的胃酸分泌抑制因子。幽门螺杆菌可刺激IL1β分泌，是目前研究Hp相关性疾病的重要细胞因子。TAKASHIMA等[7]证实IL1β介导Hp感染时的低胃酸分泌，从而使胃黏膜上皮易发生肠化生和异型增生。本研究结果显示萎缩性胃炎组较慢性表型胃炎组IL1β表达阳性率高，肠上皮化生组较异型增生组表达阳性率高，与TAKASHIMA的结果相一致，表明Hp诱导IL1β分泌，使胃酸分泌受抑制。IL1β作为慢性胃炎转归的预测指标具有一定的应用前景。

　　【参考文献】

　　[1]廖爱军，苏琦，田锋，等. 白细胞介素1B 基因多态性、幽门螺杆菌感染与胃癌发生的相关性 [J]. 肿瘤防治研究, 2007, 34(6):416419.

　　[2]徐顺福，施瑞华，苗毅. 幽门螺杆菌 CagA及其致病机理的研究进展 [J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2007, 16(3):298300.

　　[3]ELOMAR GM. The importance of interleukin 1β in helicobacter pylori associated disease [J]. Gut, 2001, 48(6):743747.

　　[4]胡伏莲，周殿元. 幽门螺杆菌感染的基础与临床 [M]. 北京：中国科学技术出版社, 2002:6.

　　[5]CRAANEN ME, BLOK P, DEKKER W, et al. Subtypes of intestinal metaplasia and Helicobacter pylori [J]. Gut, 1992, 33(5):597600.

　　[6]陈孝，王孟薇，尤纬蒂. 胃黏膜上皮异型增生细胞增殖活性及凋亡与幽门螺杆菌感染的关系 [J]. 癌症, 2003, 22(3):244247.

　　[7]TAKASHIMA M, FURUTA T, HANAI H, et al. Effects of Helicobacter pylori infection on gastric acid secretion and serum gastrin levels in Mongolian gerbils [J]. Gut, 2001, 48(6):765773.