几丁糖-胶原-得宝松缓释凝胶防止周围神经粘连的实验研究

　　作者：陈维波，兰丽琴，缪道一，朱 其 作者单位：325200 浙江瑞安，瑞安市人民医院手外科

　　【摘要】 目的 评价周围神经损伤后，神经缝合口局部应用几丁糖-胶原-得宝松缓释凝胶抑制瘢痕增生、促进神经再生的作用。方法 45只成年雄性SD大鼠随机为三组(A 组:单纯神经缝合组;B组: 单纯缝合+几丁糖-胶原组;C组: 单纯缝合+几丁糖-胶原-得宝松组)，每组15只。分别术后4、8、12 周行大体观察、组织学检查、神经电生理检查和图像分析。结果 单纯缝合+几丁糖-胶原-得宝松组神经吻合口局部瘢痕增生和粘连程度较其他组明显减轻，再生神经纤维较直，排列结构较整齐;电生理检查12周后，CMAP明显优于其他组。结论 几丁糖-胶原-得宝松凝胶能有效防止周围神经修复后局部瘢痕增生和粘连的形成，提高神经功能恢复。

　　【关键词】 几丁糖-胶原;得宝松;神经再生;瘢痕

　　【Abstract】 Objective To investigate the preventive effect of Chitolsan-collagen diprospan gel on scar formation following peripheral nerve injuries.Methods The right tibial nerve of 45 SD-rats were transected,immediately repaired and then randomly divided into three groups: A (control group),B(treated with Chitolsan-collagen gel) and C(treated with Chitolsan-collagen diprospan gel).At 4 weeks,8 weeks and 12 weeks after surgery procedure,general observation,electrophysiological study and immunological labeling were performed.Results Scarring formation in C group was significantly less than B and A group.CMAP of C group was remarkably higher than B and A group,which seemed to be paralleled with general observation.Further,immunological labeling showed that neuronal fibers were lined orderly in C group.Conclusion Chitolsan-collagen diprospan gel was effective in reducing scar formation and enhancing peripheral nerve regeneration.

　　【Key words】 Chitosan-collagen gel; Diprospan; Nerve regeneration; Scar

　　应用显微缝合技术修复周围神经损伤是目前临床上常用的方法，但是单纯缝合后由于炎症反应等造成局部瘢痕组织增生粘连直接影响了神经修复的效果[1,2]。瘢痕组织主要通过两种方式影响神经功能的恢复，一是与损伤神经粘连,直接压迫神经;二是瘢痕生长入缝合口间隙，阻碍近端再生的神经纤维通过缝合口。几丁糖-胶原复合膜是一种具有缓释功能的可降解材料[3]。本课题以大鼠为实验模型，将长效甾体类激素得宝松加入几丁糖-胶原凝胶中，并将其应用于神经缝合口周围，达到促进神经再生的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 几丁糖-胶原-得宝松缓释放系统制备

　　取3%酸溶性几丁糖(上海其胜生物制剂有限公司)与1.5%胶原(Sigma公司)以1：9的比例混合,再逐渐加入得宝松(Schering-Plough Labo N.v.,Belgium)混悬液，浓度为1ml，充分混合60min，经特殊工艺制成几丁糖-胶原-得宝松缓释凝胶，4℃下存放。

　　1.2 动物与分组

　　选用SD(中科院实验动物中心提供))大鼠45只,雄性,体重150g左右。随机分为三组。A 组:单纯神经缝合组;B组: 单纯缝合+几丁糖-胶原组;C组: 单纯缝合+几丁糖-胶原-得宝松组。每组15只大鼠。

　　1.3 手术方法

　　大鼠以10g/L戊巴比妥钠(40mg/ kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定。取大鼠股后部斜切口，分开臀肌，在放大6倍的手术显微镜下解剖胫神经，于膝关节上缘5mm处切断胫神经，以神经外膜上血管走行为标记，9-0无损伤线缝合神经外膜6针，针距与边距大小以使轴突不膨出、外膜不内翻为宜。A 组:神经切断后直接缝合;B 组: 神经切断后直接缝合，在吻合口10mm 的范围内注射几丁糖-胶原凝胶;C组:神经切断后直接缝合，在吻合口10mm 的范围内注射几丁糖-胶原-得宝松缓释凝胶。

　　1.4 检测指标

　　术后4、8、12 周分别检测下列项目。

　　1.4.1 大体观察

　　取材时切开伤口观察皮肤、肌肉和筋膜愈合情况，神经吻合口与周围肌腔隙粘连情况，几丁糖-胶原在体内降解吸收情况。

　　1.4.2 电生理检查

　　术后4、8、12 周,麻醉方法同上。显露手术侧胫神经,用意大利ESAOTE 公司的Phasis四道程肌电诱发仪检测。在神经近端刺激,腓肠肌记录并计算运动神经传导速度和动作电位波幅。

　　1.4.3 组织学检测

　　以胫神经吻合为中心切取神经约1cm,标记后以体积分数为4%多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水,纵切面连续切片，厚约5μm，胫神经冰冻切片贴片→0.01M PBS洗3次，每次10min→0.1%Triton破膜10min→0.01M PBS洗3次，每次10min→2%BSA室温下封闭30min→去血清，加入 GAP43单克隆抗体(dilution 1:200; Abcam)，4℃过夜→0.01M PBS洗3次，加荧光二抗：IgG-CY3，室温下避光作用2h→透明、封片、荧光显微镜下观察并拍照(Axiocam MR R3,Carl Zeiss,Germany)。

　　1.4.4 计算机图像分析

　　术后12周，经缝合口远、近端横切面做半薄切片，甲苯氨蓝髓鞘染色。采用K-400图像分析系统进行分析，计算远端神经轴突的平均直径和有髓神经纤维再生率。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据用(x±s)表示,实验组数据与对照组数据间用非配对t检验,检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 伤口大体观察

　　所有大鼠在麻醉下切开伤口观察皮肤、肌肉和筋膜愈合情况以及神经吻合口与周围组织的粘连情况(图1)。术后4周，几丁糖-胶原凝胶降解不明显;术后8周，该凝胶明显降解吸收;术后12周时该凝胶完全降解吸收。术后12周，A 组的神经缝合口处增粗,与周围组织粘连明显;B 组的神经缝合口处增粗，与周围组织粘连不明显;C组的神经缝合口光滑与周围组织无明显粘连。

　　2.2 电生理检测结果

　　见表1。术后4周B、C组的肌电检测偶见电位,A组为电静息。术后8周,刺激神经远、近端及导管处,三组均出现复合肌肉动作电位,B、C组与A组相比，运动神经传导速度和CMAP波幅的差异有统计学意义(P<0.05)，B与C组无论是运动神经传导速度还是CMAP波幅的差异无统计学意义(P>0.05);术后12周,B与C组运动神经传导速度差异无统计学意义(P>0.05),而CMAP波幅的差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。表1 术后8、12周神经电生理检查结果比较

　　2.3 荧光显微镜观察结果

　　各组均有再生神经纤维通过吻合口向远端生长。C组纵切面上观察有较多再生神经纤维通过缝合口,神经纤维较直，排列结构较为整齐;B组纵切面上观察有较多再生神经纤维通过缝合口,部分神经纤维扭曲，排列欠整齐;A组纵切面上见缝合口局部被瘢痕压迫而有不同程度狭窄，通过缝合口的再生神经纤维扭曲明显，排列不整齐(图3)。

　　2.4 计算机图像分析结果

　　术后12周，三组轴突的平均直径和有髓神经纤维再生率相比较发现，C组>B组>A组，差异有显著性(P<0.05)，见表2。表2 术后12周计算机图像分析结果比较

　　3 讨论

　　周围神经损伤是临床上常见的损伤，修复的方法主要是显微外科缝合。研究表明，周围神经损伤后的再生是一个相当复杂的过程，受到局部甚至整体多种因素的影响[4]。显微缝合后神经缝合口处瘢痕组织的增生和局部与周围组织的粘连不仅影响局部的微循环，而且瘢痕早期可阻碍再生轴突向远端延伸，晚期又可能牵拉压迫周围神经，造成神经纤维排列结构紊乱，是影响周围神经修复后功能恢复的主要因素之一[5]。单纯应用各种促进神经生长的药物或其他手段，往往不能获得理想的效果。这是目前周围神经损伤修复研究领域的一项亟待解决的难题。因此,研究预防周围神经术后的瘢痕增生，提高周围神经修复疗效，改善功能恢复，是当前国内外研究的热点。

　　目前研究主要集中在两方面[6～8]，一是利用生物制剂阻隔神经缝合口和周围组织以达到物理防粘连的效果;二是利用一些甾体类激素抑制炎症反应的药理作用以达到防止瘢痕增生的效果。但总体效果均不令人满意。迄今为止，将这两方面结合，取长补短，使得物理阻隔和药理作用能持久、无副作用地同时发挥，促进神经再生的作用，国内外尚无报道。

　　几丁糖(Chitosan)具有较好的组织相容性，极强的生物活性，良好的生物降解性。不同浓度的几丁糖及其衍生物一方面促进成纤维细胞的增殖和迁移，有利于新生修复组织的结构重塑和构建，能增强或恢复伤口愈合的力学强度;另一方面抑制成纤维细胞的过度增殖，防止瘢痕增生，有助于外观和功能的恢复，使伤口得到高质量的愈合。因此，可以作为局部缓释药物的良好载体，有研究通过动物实验证实[9]，几丁糖庆大霉素药物释放系统在治疗骨感染方面具有较好的体内、外缓释作用，使用简单、方便、安全、无需二期取出。但是，几丁糖在体内降解需要较长时间。

　　胶原(Collagen)具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原性，已广泛应用于药物载体系统和人造血管、瓣膜等组织工程领域。胶原可应用于医药领域的一个主要原因在于它经过自聚和交联,可形成具有一定强度和稳定性的结构,用弱酸水提取后可制成多种形式的药物载体系统。

　　随着生物技术的迅速发展，已可合成各种不同降解速度及力学性能的生物材料。同时，局部缓释使药物的安全性、有效性和适应性都有所提高，该技术在抗炎及抗肿瘤等方面都显示了其应用价值[10～13]，在促进神经再生方面也已有了一些尝试[14,15]。几丁糖-胶原复合膜就是一种新型的生物可降解复合材料，既增加了材料的柔韧性,又可根据需要制备成不同降解时间的缓释膜[16～18]。

　　本研究将几丁糖-胶原制备成凝胶状，方便临床应用，同时将长效甾体类激素得宝松加入这种几丁糖-胶原凝胶中，应用于神经缝合口周围。一方面防止瘢痕组织长入神经缝合口，使更多的再生轴突通过缝合口，到达靶器官;另一方面通过缓慢、持续释放甾体类激素，可防止神经周围瘢痕增生，减少瘢痕组织对损伤神经的卡压及对血供的影响。结果显示，应用该凝胶后，神经缝合口周围瘢痕增生显著减少，与周围组织粘连不明显。组织学检查发现再生神经轴突数量高于其他两组且排列较为整齐。电生理检查显示，在12周，CMAP的波幅高于其他两组。

　　因此，笔者认为：将加入得宝松的几丁糖-胶原凝胶应用于缝合后的神经,借助其物理隔离及缓慢释放甾体激素的功能，使产生协同效应，可起到持久、恒定的瘢痕抑制作用，从而达到促进神经再生、提高神经功能恢复的作用。为解决促进周围神经再生这一难题提供了一种新的方法。

　　(本文彩图见封三)

　　【参考文献】

　　1 Silver J,Miller JH.Regeneration beyond the glial scar.Nat Rev Neurosci, 2004,5(2):146-56.

　　2 Fenrich K,Gordon T.Canadian Association of Neuroscience review: axonal regeneration in the peripheral and central nervous systems-current issues and advances.Can J Neurol Sci,2004,31(2):142-56.

　　3 魏欣，劳杰，顾玉东.几丁糖-胶原复合膜促进周围神经再生的实验研究.上海医学，2001,24(9)：534-537.

　　4 Widerberg A,Lundburg G,Dahlin LB.Nerve regeneration enhancement by tourniquet.J Hand Surg(Br),2001,26:347-351.

　　5 Dyck PJ,Thomas PK,Griffin JW,et al.Peripheral neuropathy.WB Saunders,London,1995.

　　6 Nachemson AK,Lundborg G,Myrhage R,et al.Nerve regeneration and pharmacological suppression of the scar reaction at the suture site.An experimental study on the effect of estrogen-progesterone,methylprednisolone-acetate and cis-hydroxyproline in rat sciatic nerve.Scand J Plast Reconstr Surg,1985,19(3):255-260.

　　7 Ozgenel GY.Effects of hyaluronic acid on peripheral nerve scarring and regeneration in rats.Microsurgery,2003,23(6):575-581.

　　8 Abarrategi A,Civantos A,Ramos V,et al.Chitosan film as rhBMP2 carrier: delivery properties for bone tissue application.Biomacromolecules,2008,9(2):711-718.

　　9 陈爱民，侯春林，顾琪胜，等.几丁糖庆大霉素药物释放系统的研究.中华外科杂志，2000,38(2)：137-139.

　　10 Takezawa T,Takeuchi T,Nitani A,et al.Collagen vitrigel membrane useful for paracrine assays in vitro and drug delivery systems in vivo.J Biotechnol,2007,131(1):76-83.

　　11 Ganguly S,Dash AK.A novel in situ gel for sustained drug delivery and targeting.Int J Pharm,2004,276(1-2):83-92.

　　12 陈爱民,侯春林,屠开元.几丁糖庆大霉素药物释放系统的研制及体外释放实验.中华骨科杂志,1997,17(9)：591-593.

　　13 Elhassan Imam M,Bernkop-Schnurch A.Controlled drug delivery systems based on thiolated chitosan microspheres.Drug Dev Ind Pharm,2005,31(6):557-565.

　　14 张振伟,廖坚文,张日华,等.FK506缓释膜片促进外周神经再生的实验研究.中华显微外科杂志,2002,25:44-46.

　　15 Saito K,Fujieda T,Yoshioka H.Feasibility of simple chitosan sheet as drug delivery carrier.Eur J Pharm Biopharm,2006,64(2):161-166.

　　16 魏欣,劳杰,顾玉东.几丁糖-胶原复合膜促进周围神经再生的实验研究.上海医学,2001,(24):534-537.

　　17 侯春林,顾其胜.几丁质与医学.上海:上海科学技术出版社,2001：53-54

　　18 Palmberger TF,Hombach J,Bernkop-Schnürch A.Thiolated chitosan: development and in vitro evaluation of an oral delivery system for acyclovir.Int J Pharm,2008，348(1-2):54-60.