EGFL7基因沉默对裸鼠胃癌血管生成的影响

　　作者：刘志勇， 欧阳忠， 邹小明 作者单位：(赣南医学院第一附属医院 乳腺外科, 江西 赣州 341100; 哈尔滨医科大学附属第二医院 胃肠外科, 黑龙江 哈尔滨 150086)

　　【摘要】 目的： 探讨类表皮生长因子域7(EGFL7)基因沉默对胃癌裸鼠模型瘤内血管生成的影响。方法: 构建EGFL7短发夹状RNA表达质粒并转染SGC7901细胞(psh EGFL7组),以空质粒转染为对照组，观察两组皮下种植瘤生长曲线及体积;免疫组织化学法检测抗CD34、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板反应蛋白( TSP1)表达，RTPCR 检测MMP2 和TIMP2 表达。结果: psh EGFL7组种植瘤体积为(1.86±0.65)cm3,微血管密度(MVD) 为20.84±6.38 ,分级为1～2级;对照组种植瘤体积为(4.86±1.15)cm3,MVD为39.48±9.01, 分级为3～4级;两组种植瘤体积、MVD和分级的差异有统计学意义,P值均<0.05;EGFL7组TSP1蛋白阳性表达, 而VEGF蛋白为弱阳性或阴性表达,MMP2 mRNA 表达下调,而TIMP2 mRNA表达上调,与对照组比较差异有统计学意义,P值均<0.01。结论: EGFL7基因沉默可降低胃癌种植瘤血管生成,与调节MMP2/TIMP2表达,影响VEGF/TSP1平衡有关。

　　【关键词】 基因沉默; 血管; 癌; 胃; 表皮生长因子; 小鼠，裸

　　Effect of Epidermal Growth Factorlike Domain 7 Gene Silencing on Angiogenesis of Stomach Carcinoma in Nude Mice

　　LIU Zhiyong, OUYANG Zhong, ZOU Xiaoming

　　( Department of Breast Surgery,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou 341000, Jiangxi,

　　China;The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of epidermal growth factorlike domain 7 (EGFL7) gene silencing on angiogenesis of stomach carcinoma in nude mice and its mechanism. Methods: A short hairpin RNA (shRNA) vector targeting at EGFL7 gene was constructed and transfected into SGC7901 cells (pshEGFL7 group),and cells transfected with blank plasmids served as control group. Positive clones were selected and transplanted in nude mice to produce tumor animal model. Growth curves and volumes of tumors were observed. After 8 weeks, EGFL7 mRNA and protein in transplanted tumor tissues were detected and graded,and CD34, VEGF and TSP1 tested with immunochemistry method, and MMP2 and TIMP2 mRNA detected with RTPCR. Results: In pshEGFL7 group, the tumor volume was (1.86±0.65)cm3, and microvessel density (MVD) was 20.84±6.38, while in control group, tumor volume was (4.86±1.15)cm3, and MVD was 39.48±9.01. The differences between the two groups were significant (P<0.05).TSP1 protein expressed positively, and VEGF protein presented weakly or negatively in pshEGFL7 group. The expression of MMP2 mRNA decreased, while TIMP2 mRNA increased in pshEGFL7 group, and the differences were significant statistically compared with those of control group (P<0.01). Conclusions: Silencing of EGFL7 gene can dicrease angiogenesis of stomach cancer in nude mice, which might relate to regulation of expression of MMP2/TIMP2 and influence on balancing of TSP1/VEGF.

　　[Key words] gene silencing; carcinoma; stomach; blood vessels; epidermal growth factor; mice,nude

　　胃癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国常见的恶性肿瘤中，胃癌发病率居第二位，死亡率则位居第一,严重危害人类健康[1]。类表皮生长因子域7(EGFlike domain 7，EGFL7)属于分泌型蛋白，包含两个生长因子类似的结构域，但其具体功能尚不确切。新近的研究发现EGFL7涉及血管形成过程中成管这一关键性的步骤[2]。本研究采用RNAi技术，构建了诱导人胃细胞株中EGFL7基因表观沉默的shRNA载体，通过脂质体转染靶细胞，在分子和蛋白质水平上验证外源RNAi序列对于细胞中EGFL7基因的表达抑制及对于该细胞的增殖抑制作用。建立胃癌动物模型，探讨EGFL7基因沉默对胃癌瘤内血管生成的影响及可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　BALB/c裸鼠购自中科院上海实验动物中心,3～4周龄,共10只、雌雄不限,体重15～20 g,SPF级裸鼠室分笼饲养。RPMI1640培养基购自Gibico公司(美国)，内皮细胞生长因子支持物(endothelial cell growth supplement，ECGS)购自Sigma公司(美国)，siRNA 及脂质体lipofectamine 2000购自Ambion公司(美国)，Trizol，RT试剂盒及引物均来自Invitrogen公司(美国)，MTS[3(4,5dimethylthiaz2y1)5(3carboxymethoxypheny1)2(4sulfopheny)2Htetrazolium，inner salt]购自Promega公司(美国)。小鼠抗人CD34 单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;二甲基亚砜(DMSO)及小鼠抗人血小板反应蛋白1(thrombos pondin1,TSP1)单克隆抗体TSP1购自北京莱博公司，兔抗人VEGF多克隆抗体、通用型辣根过氧化酶标记的人抗小鼠抗体或人抗兔抗体二抗购自武汉博士德公司，DAB 显色剂为福州迈新公司产品，PCR引物由上海生工合成。其他试剂均为国产分析纯。本实验完成于2009年1月-10月。在赣南医学院基础医学院完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　细胞培养用RPMI1640培养液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L链霉素)，在37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

　　1.2.2 MTT法检测细胞生长抑制情况

　　取对数生长期的SGC7901细胞，按每孔1×10个细胞接种于96孔板中，24 h后换液;加入丁酸钠使其终浓度分别为2.5、5.0 mmol/L，每个浓度每个时点均设4个平行孔，并设不加药物的阴性对照孔和不加细胞的空白孔。CO2孵箱内继续培养24、48 h。于570 nm波长处测定每孔吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100。

　　1.2.3 重组质粒载体构建与转染及稳定株筛选

　　根据GenBank数据库提供的EGFL7基因核苷酸序列，选择设计能转录短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列，命名为EGFL7shRNA;同时设计1条非特异性序列作为阴性对照，命名negative shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆，抽取重组质粒.通过限制性内切酶SalI酶切和并DNA测序确定正确的克隆。重组表达载体转染胃癌细胞系SGC7901细胞，用含筛选浓度RPMI1640 (600 μg/mL)的完全培养基培养10 d，用有限稀释法挑单克隆并扩增获得稳定株，同时将完全培养基中RPMI1640换成维持浓度(300 mg/L)。

　　1.2.4 RTPCR检测转染细胞EGFL7 mRNA、MMP2 mRNA、TIMP2 mRNA表达水平

　　各组细胞以1.5×105/L起始浓度接种于6孔板，按上述培养方法进行siRNA转染24 h后，胰酶消化离心收集。利用Trizol抽提纯化细胞总RNA，RTPCR法测定EGFL7 mRNA、MMP2 mRNA、TIMP2 mRNA的水平，三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。EGFL7引物序列如下：正义链为5′GGGGGATGACTGATTCTC 3′，反义链为5′CCACATCTGACTGGCAAG3′。GAPDH：正义链为5′CTGAGTATGTCGTGGAGTC3′，反义链为5′CTTCTGAGTGGCAGTGAT3′。MMP2：正义链为5′GTGCTGAAGGACACAACTAAAGAAGA3′,反义链为5′TTGCCATCCTTCTCAAAGTTGTAGG3′;TIMP2：正义链为5′CGGATCCGTTTTGCAATGCAGATGTAG3′,反义链为5′TGAATTCATGTGGAGAAACTCCTGCTT3′。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，于紫外凝胶图像分析仪上观察、分析和摄片。

　　1.2.5 蛋白质印迹法检测EGFL7蛋白表达

　　提取转染后4周种植瘤块蛋白质。应用SDSPAGE电泳和免疫印迹。采用Bradford法测定蛋白质浓度,在非还原的条件下经12%的SDSPAGE凝胶进行电泳分离,转移至硝酸纤维素膜上,在含5%脱脂奶粉的PBS中4 ℃孵育过夜,加入1∶1 000兔抗人EGFL7多克隆抗体,室温下作用1 h,与1∶1000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作用1 h,ECL显影,压片,观察结果。

　　1.2.6 裸鼠人胃癌模型的建立及鉴定

　　转染后4周,取2×107/ml对数生长期的pshEGFL7组和对照组单细胞悬液各1.25 ml,分别于裸鼠右胁腹前肢皮下注射0.25 ml/只。2～3周开始成瘤后,每周测量瘤直径;至第8周末断颈处死后完整分离瘤块,称质量,手术显微镜下游标卡尺测量肿瘤长短径,计算瘤体积。完整肿瘤组织石蜡包埋,厚度30 μm/片,连续切片10张,片厚5 μm，HE染色。按成瘤的裸鼠数计算成瘤率。肿瘤体积=长径(a)×短径(b)2×0.5。

　　1.2.7 常规免疫组织化学

　　石蜡切片常规脱蜡至水,pH 6.0的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波92～98 ℃，抗原修复,0.05%胰酶37 ℃孵育30 min,3% H2O2作用10 min, 加入工作液浓度为1∶100的小鼠抗人CD34和TSP1单克隆抗体,工作液浓度为1∶200 的兔抗人VEGF多克隆抗体,4 ℃过夜。复温后滴加二抗,孵育相应时间,DAB显色,苏木精复染。CD34 以血管内皮为阳性对照,指标均用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 1310 进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示,应用t检验,以P≤0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RNA干扰对细胞增殖的影响

　　从第2天开始，实验组细胞增殖率就高于阴性对照组，EGFL7表达抑制后，随着时间延长,差距变大，细胞增殖率明显升高，P<0.01，见表1及图1。表1 实验组与对照组的细胞抑制率(略)

　　2.2 EGFL7 mRNA和蛋白表达情况

　　RTPCR和Westernblot检测EGFL7 mRNA 的表达结果见图2。阳性干扰组中EGFL7mRNA条带(425 bp)的亮度明显低于阴性对照组，统计软件分析显示阳性干扰组与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.01)。EGFL7 的蛋白表达结果，阳性干扰组中EGFL7 蛋白(170 kD)表达的强度明显弱于阴性对照组，阳性干扰组与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

　　2.3 病理检查结果

　　模型成瘤率为100 %(10/10) 。psh EGFL7组潜伏期(自种植日开始至可触及皮下瘤块)为(16.6±1.8)d ,对照组为(12.0±1.6)d,两组比较t=4.271,P=0.003。潜伏期后皮下瘤块直径两组差异有统计学意义,P<0.05(图4);至8周末,对照组4只出现衰竭征象,体型瘦弱,全身皮肤散在出血点,瘤体表面血管透见,伴糜烂和溃疡,解剖见肿瘤呈微浸润性生长,包膜不完整,表面淡红色, 血管网清晰, 切面见内部出现坏死液化;pshEGFL7组包膜较完整,2个瘤体内出现少量坏死。pshEGFL7组瘤体积为(1.86±0.65) cm3,对照组为(4.86±1.15)cm3,两组差异有统计学意义, t=5.082,P=0.001。HE染色显示癌灶呈团块状,细胞多角形,可见胞质丰富,颗粒状;胞核大而不规则,核膜厚,核仁明显,染色质边集,核质比例增大等异形性改变。

　　2.4 微血管密度(MVD)计数

　　种植瘤微血管呈点状和环状棕色染色,“热点”出现在肿瘤边缘、包膜或纤维间隔和坏死组织处。pshEGFL7组以点状为主,而对照组出现环状毛细血管样形态,两组MVD分别为20.84±6.38和39.48±9.01,t=8.441,P=0.001。见图5。

　　2.5 TSP1和VEGF 的表达

　　TSP1在少数胃癌细胞的细胞质及细胞外间质中呈阳性表达,染色为棕黄色,psh EGFL7组表达显著高于对照组(图6A、B);VEGF蛋白表达主要见于胃癌细胞胞质内,呈棕褐色颗粒状;在血管内皮细胞上呈阳性表达,见于CD34热点区,对照组表达明显高于psh EGFL7组(图6C、D)。两组纤维包膜处均见TSP1、VEGF阳性表达,为微血管状棕色染色。

　　2.6 MMP2 和TIMP2 mRNA的表达

　　在444 bp和556 bp处可见特异性条带出现,是MMP2和TIMP2表达。pshEGFL7组MMP2 表达明显下调, TIMP2表达上调(图7)。MMP2和TIMP2与GAPDH的相对灰度比两组比较,t分别为11.34,8.44,P值均<0.01。

　　3 讨论

　　胃癌的组织类型以腺癌为主，对化疗敏感性差，正常胃肠对放射线的耐受力也低，5年生存率低。因此，寻找更有效的治疗手段是改进胃癌治疗现状的重要课题之一。RNA干扰(RNA interfernce，RNAi)是指由非编码小分子RNA (siRNA、microRNA)诱导的，通过靶向沉默基因mRNA的正常表达来调控宿主发育和细胞分裂的转录水平修饰行为。

　　RNAi机制主要表现为线形双链RNA (dsRNAs)通过Dicer酶的加工被切割为21～24 nt长度的小分子干扰RNA (siRNA)，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)催化下形成RNA沉默复合物(RISCs)，通过与同源mRNA的特异配对，引导RISC特异地降解同源mRNA，导致基因表达的抑制，最终导致该基因的翻译沉默。因此小片段的siRNA也可以诱导高效的基因沉默[3]。pshEGFL7组种植瘤块EGFL7 mRNA 表达较对照组显著下调,表明构建的RNAi重组质粒发挥了抑制EGFL7活性的作用。pshEGFL7组成瘤潜伏期延长,生长受抑制,表明靶向EGFL7基因的shRNA通过抑制EGFL7活性,可延缓胃癌生长。

　　EGFL7是新近发现的一种内皮细胞特异性生长因子类似物。细胞恶变最突出的特征是生长失去抑制，因此，正确统计肿瘤中增殖细胞所占比例，即增殖指数，对评价肿瘤细胞生长有较大意义。同时，检测肿瘤增殖活性可对肿瘤生物学行为判断具有预测意义。本研究MTT法结果显示对照组细胞增殖率高于实验组，随着时间延长.差距变大，细胞增殖率升高。

　　肿瘤细胞的恶性失控生长和高代谢状态使实体肿瘤组织内存在缺氧状态，在缺氧的肿瘤组织中，主要是通过生成新生血管以保持旺盛的增殖活力，EGFL7涉及血管形成过程中成管这一关键性的步骤。目前已知EGFL7基因属于一个小基因家族，编码产物为含273AA的分泌蛋白，由内皮细胞及其原始细胞分泌产生。EGFL7因子被血管内皮细胞(EC)分泌后停留在EC附近，表明其可能跟细胞外基质相关，介导细胞间相互作用。用放射原位杂交检查EGFL7的表达谱后发现，血管生长和塑型活跃的肿瘤组织中EGFL7的表达呈显著上M:100 bp Marker;1和2:MMP mRNA表达;3和4:TIMP2mRNA表达;1和3:psh EGFL7组;2和4 :对照组调[4,5]，这种独特的表达方式表明EGFL7可能与肿瘤血管的生长和塑型相关，其在胃癌中的表达及对胃癌新生血管形成的影响与作用机制尚未见报道。

　　原发性胃癌是典型的多血管肿瘤,伴有术后早期复发及高死亡率的特征。在本实验中,pshEGFL7组微血管散在分布,呈血窦形点状MV,MVD计数少,对照组MV数量多,且形态也多呈环状和条索状毛细血管形或混合型。有研究显示,MV形态和MVD可作为原发性胃癌的病理进展和预后不良的预测指标[6]。

　　有研究表明,在原发性胃癌中VEGF高表达,是刺激血管生成作用最强的因子之一[7]。在本实验中, pshEGFL7组VEGF表达降低,表明抑制EGFL7活性发挥抗种植瘤生长与转移的作用是由于阻断了肿瘤生长所必须的血管生成有关。

　　TSP1属于基质蛋白家族成员,是细胞外基质(ECM)表达的一种抗血管生成因子,在肿瘤的生长迁移、降解ECM和血管生成方面有重要作用[8]。在本实验中,pshEGFL7组MMP2表达下调, TIMP表达上调,一方面TSP1通过活化TGFβ使TIMP表达增多,另一方面是MMP如MMP2 、MMP9 的表达减少,MMP2表达水平与癌症术后复发转移成正相关[9]。pshEGFL7组TSP1为强阳性表达,而MVD数量少,表明TSP1 表达的高低与肿瘤血管的多少呈负相关,因此TSP1发挥作用的一条重要途径为抑制胃癌的血管生成。

　　综上所述,抑制EGFL7活性可调节肿瘤的ECM与肿瘤局部微环境的变化,通过调节肿瘤的促进或抗血管生成因子的分泌,起到抑制肿瘤血管生成,减少肿瘤生长及转移的作用。

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