托吡酯对慢性癫疒间大鼠海马碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

托吡酯对慢性癫疒间大鼠海马碱性成纤维细胞生长因子表达的影响作者：周旭平,包仕尧,楚冰    作者单位：215004 苏州大学附属第二医院神经内科    【摘要】  目的 研究托吡酯（TPM）对慢性癫疒间大鼠海马碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法 制作戊四氮（PTZ）慢性癫疒间点燃大鼠模型，分为PTZ组、TPM组及正常对照组，每组又以5 d、10 d、15 d 3个时间点各分为3小组。免疫组化法观察各组海马CA1、CA3区及齿状回bFGF表达，HE染色观察病理形态学改变。结果 （1）行为学观察：PTZ组和TPM组在癫疒间发作上无明显差别。（2）bFGF表达：①各组齿状回区bFGF表达：PTZ组和TPM组各时点表达不断增高，与正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01），尤以10 d及15 d时增高更明显，与5 d时比较差异有统计学意义（均P<0.05）。②各组CA1区bFGF表达：PTZ组各时点均有明显表达，且随时间延长而表达不断增高，各时点比较差异有统计学意义（均P<0.01），与正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01）；TPM组在5 d时与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），而10 d、15 d 时逐渐下降，接近正常对照组水平。③各组CA3区bFGF表达：5 d时3组比较差异无统计学意义。但PTZ组和TPM组在10 d时与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），PTZ组在15 d时和TPM组及正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01）。（3）病理形态学改变：PTZ组和TPM组的海马CA1、CA3区尤其是CA1区可见较多神经元发生变性和坏死，PTZ组更显著。结论 PTZ点燃过程中海马bFGF表达增高，尤其在CA1区，且随时间延长有表达不断增高的趋势。TPM可能通过减少海马神经元损伤而明显下调海马CA1、CA3区bFGF的表达。    【关键词】  托吡酯；碱性成纤维细胞生长因子；癫疒间　　Effect of Topiramate on the basic fibroblast growth factor expression in hippocampus of a chronic epileptic rat ZHOU Xuping, BAO Shiyao, CHU Bing.Department of Neurology, Second Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215004, China    Abstract：Objective  To determine whether Topiramate (TPM) has an effect on basic fibroblast growth factor (bFGF) expression in hippocampus in a chronic kindling rat model of epilepsy.Methods  Chronic kindling rat models were established by pentetrazole (PTZ) and divided into three groups: PTZ group, TPM group and normal control group. Each group then divided into three subgroups according to different time point of kindling (5, 10 and 15 d). The expressions of bFGF in CA1, CA3 and dentate gyrus areas of hippocampus were detected by immunohistochemistry method. The cellular morphologic changes were observed by HE staining method.Results  (1) There was no difference of epileptic praxiology between PTZ and TPM groups. (2) Compared with normal control group, bFGFpositive cells in dentate gyrus in PTZ group and TPM group were increased significantly at each time point (all P<0.01)，especially at 10 and 15 d, which were more than 5 d (all P<0.05). bFGF expressions in CA1 area in PTZ group had a total increasing trend by time, and they were more than normal control group (all P<0.01). bFGF expressions in CA1 area in TPM group increased at 5 d, which was a significant difference compared with control group (P<0.01), then decreased to normal group level at 10 and 15 d. In CA3 area，there was no difference of bFGF expression among normal group, PTZ and TPM groups at 5 d. But this expression increased in PTZ and TPM groups at 10 d (P<0.01), and only PTZ group increased at 15 d (P<0.01).(3) Degeneration and necrosis of neurons in CA1 and CA3 areas (especially in CA1 area) were found both in PTZ group and TPM group. This change was more obvious in PTZ group. Conclusion  bFGF expression is increased in hippocampus during kindling by pentetrazole especially in CA1 area and there is an increasing trend by time. Topiramate can downregulate bFGF expression in CA1 and CA3 areas of hippocampus by decreasing neuron lesions.    Key words：Topiramate;basic fibroblast growth factor;epilepsy　　碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种具有多种生物活性的神经营养因子，主要作用是维持中枢神经系统的正常功能，减少各种损伤引起的神经元死亡。已研究［1］表明，bFGF对缺血性脑卒中有神经保护作用。癫疒间发作能诱导内源性bFGF在选择性脑区表达增高，尤其是海马，这可能是对癫疒间诱导的神经元变性的一种修复性反应。托吡酯（TPM）是一种具有多种作用机制的新型抗癫疒间药。近年来的研究［3,4］发现TPM可能还具有神经保护作用。在有关缺血性脑卒中和癫疒间的动物实验中都证实TPM干预能减少神经元死亡。本实验利用戊四氮（PTZ）慢性癫疒间点燃模型以探讨TPM是否对点燃过程中海马bFGF的表达有影响作用。1  材料与方法　　1.1  材料　　1.1.1  动物与分组  健康雄性SD大鼠45只，质量150～180 g，由苏州大学医学院实验动物中心提供。分组：（1）PTZ组（癫疒间大鼠，15只）：未用TPM治疗；（2）TPM组（癫疒间大鼠，15只）:TPM干预；（3）正常对照组（15只）。每组再以5 d、10 d、15 d 3个时间点各分为3小组，每组5只。　　1.1.2  试剂和仪器  PTZ购于Sigma公司。TPM为西安杨森制药有限公司产品（商品名妥泰）。超敏SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔抗大鼠bFGF购于北京中杉金桥生物技术有限公司。　　1.2  方法　　1.2.1  慢性癫疒间模型制备  采用PTZ腹腔注射［35 mg/(kg·d)］制作。观察并记录注射后1 h内实验组每只大鼠癫疒间发作的强度，按Recine标准评定［5］。正常对照组予同等量生理盐水腹腔注射。　　1.2.2  给药方法  TPM组大鼠给予TPM灌胃［200 mg/(kg·d)］,浓度为20 mg/ml），间隔1 h后再予PTZ腹腔注射。　　1.2.3  bFGF表达观察  10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，开胸暴露心脏，12号针刺入左心室尖部，剪开右心耳，快速滴注生理盐水100 ml，继以4%多聚甲醛（0.1 mol/L PBS）连续灌注，约250 ml，直至四肢、尾、肝变硬。断头取脑，取含海马结构的2～3 mm厚脑块（冠状切面），乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。做石蜡切片，片厚8 μm。切片常规脱蜡和水化后，PBS（pH 7.4）冲洗3 min×3次。免疫组化染色步骤按超敏SP试剂盒说明书操作，一抗为兔抗大鼠bFGF（浓度为1∶50），显微镜下控制DAB染色时间。蒸馏水冲洗，苏木素轻度复染，蒸馏水冲洗返蓝。梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。bFGF阳性细胞评定及计数：阳性细胞被染成棕褐色，胞浆、胞核均有着色，以胞核为主。高倍镜下（×400）用图像分析仪辅助照相，每张切片按海马齿状回（DG）、CA1、CA3区各照不重叠的3张，人工计数阳性细胞，取其均值。　　1.2.4  病理形态学观察  石蜡标本另外切片做常规HE染色，片厚5 μm，观察光镜下海马齿状回、CA1、CA3区的病理形态。　　1.2.5  统计学方法  数据采用均数±标准差(±s)表示。采用SAS 6.12统计软件，不同组组间比较采用t检验，同组不同时间点比较采用方差分析。2  结果　　2.1  行为学观察  PTZ注射6～9 d左右，大鼠开始出现Ⅰ级癫疒间发作［PTZ组为(7.30±1.08)d，TPM组为(7.45±1.19)d］，10 d以后开始出现Ⅱ级发作［PTZ组为(11.78±1.56)d，TPM组为(12.13±1.46)d］，未观察到Ⅲ级以上发作。大鼠经PTZ注射后3～5 min即开始出现癫疒间发作，一般持续15～30 min。PTZ组和TPM组在癫疒间发作级别、出现时间上无明显统计学意义。　　2.2  bFGF表达  正常大鼠海马齿状回、CA1、CA3区均有bFGF表达。PTZ组各区bFGF的表达均明显增高，尤其是CA1区，其次是齿状回、CA3区（图1）。　　2.2.1  各组齿状回区bFGF表达  见表1。PTZ组和TPM组各时点bFGF阳性细胞数明显增高，与正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01），尤以10 d及15 d时增高更明显，与5 d时比较差异有统计学意义（均P<0.05）。　　表1  实验组与正常对照组齿状回bFGF阳性细胞数的比较（略）　　注：与正常对照组比较*P<0.01，与5 d时比较△P<0.05　　2.2.2  各组CA1区bFGF表达  见表2。PTZ组各时点bFGF阳性细胞数均有明显表达，且随时间延长而表达不断增高，各时点比较差异有统计学意义（均P<0.01），与正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01）。TPM组在5 d时与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），而10 d、15 d时逐渐下降，接近正常对照组水平。　　表2  实验组与正常对照组CA1区bFGF阳性细胞数的比较（略）　　注：与正常对照组比较*P<0.01，与10 d、15 d时比较△P<0.01，与TPM组比较▲P<0.01　　2.2.3  各组CA3区bFGF表达  见表3。3组在5 d时bFGF阳性细胞数表达比较差异无统计学意义。　　表3  实验组与正常对照组CA3区bFGF阳性细胞数的比较（略）　　注：与正常对照组比较*P<0.01；与TPM组比较▲P<0.01　　但PTZ组和TPM组在10 d时与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），PTZ组在15 d时和TPM组及正常对照组比较差异有统计学意义（均P<0.01）。　　2.3  病理形态学观察  癫疒间大鼠海马CA1、CA3区尤其是CA1区可见较多神经元发生变性和固缩性坏死，且随时间延长而不断加剧。变性的神经元肿胀，体积增大，形态不规则，由典型的多角形变为圆形或三角形，胞核偏位。坏死的神经元境界不清，胞浆浓缩、深染，核碎裂。细胞排列紊乱、疏松。齿状回病理改变不明显。PTZ组较TPM组病理形态改变更为明显(图2)。　　图1  免疫组化染色（×400），bFGF阳性细胞被染成棕褐色，胞浆、胞核均有着色，以胞核为主。1A:PTZ组 5 d时CA1区；1B:PTZ组 10 d时CA1区；1C:PTZ组 15 d时CA1区；1D:TPM组 5 d时CA1区；1E:TPM组 10 d时CA1区；1F:TPM组 15 d时CA1区；1G:PTZ组 10 d时齿状回；1H:TPM组 10 d时齿状回；1I:PTZ组 15 d时CA3区；1J:TPM组 15 d时CA3区（略）　　图2  HE染色（×400），显示海马CA1、CA3区尤其是CA1区可见较多神经元发生变性和固缩性坏死；2A:PTZ组10 d时CA1区；2B:TPM组10 d时CA1区；2C：PTZ组15 d时CA3区；2D：TPM组15 d时CA3区；2E：PTZ组15 d时齿状回；2F：TPM组15 d时齿状回（略）3  讨论　　bFGF是由154个氨基酸组成的多肽类生长因子，主要作用是维持中枢神经系统的正常功能，减少各种损伤引起的神经元死亡，并对脑损伤起重要的“自我修复”作用。在中枢神经系统，bFGF主要分布于海马和大脑皮质，位于星形胶质细胞的细胞核。研究［6］发现，在海马，bFGF主要定位于CA1区神经元。本实验发现，正常大鼠海马也有一定量的bFGF基础表达，说明bFGF对维持中枢神经系统功能是必须的。当中枢神经系统受到损伤时，胶质细胞和神经元高度表达bFGF，以维持神经元的存活和促进损伤神经元的修复。研究表明bFGF对缺血性脑卒中有神经保护作用［1］，缺血性脑梗死能诱导内源性bFGF表达增高，减少神经元死亡；外源性bFGF能缩小梗死体积、促进前体神经元分化和神经轴突的生长［7,8］。　　癫疒间发作也能诱导内源性bFGF在选择性脑区表达增高，尤其是海马区。急性和慢性癫疒间的表达特点并不相同，急性癫疒间只诱导bFGF短期表达，而慢性癫疒间则能诱导bFGF的长期表达，提示两者的机制可能并不相同。一般认为［4］，bFGF的表达在癫疒间活动早期可能是由神经元活动调节，主要起到阻止神经元死亡的作用，而随后更晚时间的表达则是对癫疒间诱导的神经元变性的一种修复性反应，神经元损伤是诱导海马bFGF长期表达的一个十分重要的因素。bFGF的长期表达对维持神经元存活和再生有重要的意义。　　以往研究已证实［9，10］，在癫疒间发作尤其是持续状态后伴有脑损伤，尤其在海马有选择性的神经元坏死和脱失，而CA1区是海马主要神经元损伤的区域。具体机制不明，目前研究最多的是兴奋性神经递质介导的神经毒性作用，主要指兴奋性氨基酸如谷氨酸。本研究表明，CA1、CA3区是PTZ慢性癫疒间点燃过程中的主要细胞损伤区，尤其在CA1区可见许多神经元发生变性和坏死，细胞排列紊乱、疏松，这与已往的研究结果是一致的。　　海马bFGF表达的时空间分布各家结果不一，不同癫疒间模型的结果也不一致。Riva等［4］利用海人藻酸（KA）模型发现急性癫疒间定位于齿状回和CA1区，如持续每日诱发癫疒间则bFGF mRNA表达持续明显升高，但仅在CA1区，以星形胶质细胞标记物——神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）鉴定，发现主要是在星形胶质细胞中表达。长期效应只出现在海马的CA1区，这和CA1区是KA诱导癫疒间活动后主要细胞损伤和类星形胶质细胞增生的地方相符。本研究结果显示，与正常对照组比较，PTZ组bFGF表达的长期效应在海马的各个区都有反映，总的趋势是随时间延长而表达不断增高，但以CA1区最明显，且长期维持在较高水平，其次是齿状回和CA3区。CA1区持续高水平表达与CA1区是癫疒间后海马主要神经元损伤区域相一致，印证了bFGF长期表达是对癫疒间诱导的神经元变性的一种修复性反应。但齿状回病理改变并不明显，也说明bFGF表达还存在组织特异性。　　TPM是一种具有多种作用机制的新型抗癫疒间药，易于透过血脑屏障。主要药理机制是：（1）阻断电压依赖性钠通道；（2）激活γ氨基丁酸（GABA）引发的Cl-内流，加强GABA的活性；（3）阻滞KA/AMPA型谷氨酸受体。近年研究［1，2］表明TPM可能还具有神经保护作用，在缺血性卒中和癫疒间的动物实验中都已证实TPM能减少神经元死亡；并已证明TPM能减少癫疒间后海马神经元凋亡，其作用机制可能是阻止兴奋性谷氨酸损伤。本研究发现，PTZ组比TPM组病理形态改变更为明显，进一步证实TPM对慢性癫疒间同样能减少海马神经元损伤，从而提示TPM对慢性癫疒间可能有神经保护作用。　　TPM干预后海马各区bFGF表达有明显不同。在齿状回，bFGF表达随时间延长而不断增高，与正常对照组比较差异有统计学意义，而与PTZ组并无明显差异；在CA1区，bFGF表达随时间延长而不断降低，在10 d、15 d时已与正常对照组无明显差异；在CA3区，只有10 d组的表达与正常对照组比较有统计学意义。结果显示其长期效应只出现在齿状回，提示TPM干预能影响慢性癫疒间点燃过程中bFGF在海马CA1区、CA3区的长期表达，使其表达下调。据此推测，TPM可能是通过减少海马CA1、CA3区神经元损伤而使bFGF表达明显下调的。从而印证了海马神经元损伤是诱导bFGF长期表达的一个重要因素，同时也间接提示了TPM对慢性癫疒间可能也有神经保护作用。    有研究［11］证实TPM能抑制杏仁核点燃模型的点燃，降低发作等级。本研究为尽量避免癫疒间发作本身可能对bFGF表达的影响，因此只观察了15 d，大鼠并没有被完全点燃，严格地说，只是观察了点燃过程的一部分，初步证明TPM可能通过减少慢性癫疒间海马神经元损伤而明显下调CA1、CA3区bFGF的表达。虽然PTZ组和TPM组在癫疒间发作上并无差别，但TPM的神经保护作用与抗癫疒间作用是否有关尚须进一步研究。【参考文献】　［1］张化彪,黎杏群.bFGF和脑缺血损伤［Ｊ］.国外医学·神经病学神经外科学分册, 2002,29:62.　［2］徐元,包仕尧,李文，等.托吡酯对癫疒间大鼠海马神经元凋亡的保护作用［Ｊ］.临床神经病学杂志,2005,18:367.　［3］石静萍，刘姜冰，赵薛旭.托吡酯对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用［Ｊ］.临床神经病学杂志,2007,20:38.　［4］Riva MA, Donati E, Tascedda F, et al.Short and longterm induction of basic fibroblast growth factor gene expression in rat central nervous system following kainate injection［Ｊ］.Neuroscience,1994,59:55.　［5］高旭光,吕晓明,刘芳,等.氯化锂匹罗卡品致痫幼鼠海马结构损伤的形态学及苔藓纤维发芽研究［Ｊ］.中风与神经疾病杂志,2002,19:23.　［6］Woodward WR, Niski R, Meshul CK, et al.Nuclear and cytoplasmic localization of basic fibroblast growth factor in astrocytes and CA1 hippocampal neurons［Ｊ］.J Neuroscience,1992,1:42.　［7］Kawamata T, Dietrich WD, Schallert T, et al.Intracisternal basic fibroblast growth factor enhances functional recovery and upregulates the 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