成人喉乳头状瘤组织中HPV/E7、ki67表达与微血管密度的相关性

作者：赵秋良 作者单位：山东大学医学院， 济南 250012 《山东大学学报（医学版）》2007年10月45卷10期 文章 【摘要】  目的 探讨人乳头状瘤病毒、细胞增殖活性及新生血管的生成在喉乳头状瘤中的作用。方法 选取21例成人喉乳头状瘤组织标本，以14例声带息肉和14喉鳞癌组织标本为对照组,PCR方法检测HPV16/E7的表达,免疫组化法检测Ki67、CD34的表达。结果 HPV16/E7在声带息肉、成人喉乳头状瘤和喉鳞癌组织中的阳性表达率分别为:14.3%、66.7%、85.7%；Ki67标记指数（labeling index,LI）分别为6.30±2.03、13.73±3.42、25.55±3.92；MVD分别为3.97±1.38、14.61±1.64、25.34±2.63；差异有统计学意义(P＜0.01)。HPV16/E7, CD34和Ki67呈正相关（r＝0.854,P＜0.01;r=0.878,P＜0.01)。结论 Ki67、MVD与细胞的增殖活化程度明显相关，可以作为反映成人喉乳头状瘤恶变潜能的指标之一。

【关键词】  喉肿瘤;喉乳头状瘤 增殖细胞抗原 CD34

    ZHAO Qiuliang, LI Haiyan

    (School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012,  China)

    Abstract: Objective  To explore the role of HPV16/E7,  cellular proliferation activity and tumor angiogenesis in laryngeal papilloma(LP) in adults. Methods   Twenty tissues of LP in adults were selected in the experimental group, and 14 tissues of vocal cord polyps (VCP) and 14 tissues of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC) were enrolled in the control groups. Expression of HPV16/E7 was determined by the polymerase chain reaction(PCR) method, and of Ki67 and CD34 by the immuneohistochemical SP method. Results  The expression rate of HPV16/E7 in VCP, LP and LSCC was 14.3%, 66.7%, and 85.7%, respectively. The labeling index(LI) of Ki67 was 6.30±2.03, 13.73±3.42, and 25.55±3.92, respectively. The number of MVD was 3.97±1.38,14.61±1.64, and 25.34±2.63, respectively. The difference was significant (P＜0.01). The level of HPV16/E7, CD34 was positively correlated with that of Ki67  in the tissues（r=0.854,P＜0.01; r=0.878,P＜0.01）. Conclusion   Ki67 and MVD highly correlates with tumor angiogenesis, cellular proliferation activity and pathological types, and they can  serve as  malignant indicators for LP in adults.

    Key words: Laryngeal neoplasms； Laryngeal papilloma； Proliferating cell antigen； CD34    喉乳头状瘤是喉部常见的良性肿瘤,多发生于儿童,但成人喉乳头状瘤易恶变［1］。研究表明,人乳头瘤病毒与喉乳头状瘤、喉鳞癌的发生密切相关。本研究拟采用RTPCR方法对成人喉乳头状瘤、喉 鳞癌中HPV16/E7进行检测,探讨HPV在成人喉乳头状瘤、喉鳞癌中的作用及意义。同时通过检测Ki67和CD34，探讨细胞增殖活性和微血管生成在成人喉乳头状瘤中的作用及相互关系。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  济南市中心医院病理科2000年1月 2006年10月存档标本，其中喉乳头状瘤21例，男14例，女7例，平均48.4岁；喉鳞癌14例,男11例，女3例，平均61.7岁；声带息肉14例，男9例，女5例，平均38.5岁。所有患者术前均未接受放疗和化疗。标本经10% 福尔马林固定, 常规石蜡包埋。所有病例均经复查, 临床及病理诊断无误。

    1.2  试剂  HPV16/E7基因上游引物：5′AGCTCAGAGGAGGAGGATGA3′,下游引物：5′GGTTTCTGAGAACAGATGGG3′,由上海生工试剂公司合成，预计扩增片段长度为203?bp；PCR试剂盒购自上海生工试剂公司。单克隆抗体Ki67、 CD34和SP检测试剂盒购自中山生物公司。

    1.3  方法  石蜡包埋组织切片厚度5?μm, 5 10片装入EP管, 加入二甲苯过夜,100％乙醇3次各1?h去二甲苯, 空气干燥后加DNA提取液50?μL,37?℃过夜,煮沸10?min,离心后取上清液2?μL,加入反应管内混匀离心,阳性对照含有HPV病毒DNA,阴性对照以蒸馏水代替,置PCR循环仪上按下列条件扩增:93?℃ 3?min预变性,然后按95?℃ 1?min →55?℃ 1?min →72?℃ 2?min, 共40个循环, 最后置72?℃保温5?min。取扩增产物10?μL, 加入2％的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,紫外灯下观察结果并照相。免疫组化步骤按试剂说明书进行，以已知阳性片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。

    1．4  结果判断  ① Ki67:以细胞核内出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞标志,每一个标本在低倍镜下观察并选取5个最有代表性的Ki67染色阳性视野,在高倍镜下计至少1?000个细胞中的阳性细胞,计算其阳性细胞数百分比数,取其平均值作为Ki67标记指数；② CD34MVD：血管内皮细胞呈棕色或棕黄色，MVD检测采用 Weidner 法［2］：先用100倍光镜扫视整个切片，选择5个微血管密度最高区,200倍光镜下记数被抗 CD34抗体染色的血管数目，取5个视野的微血管数平均值，分别记作该标本的MVD值。

    1．5  统计学处理  采用SPSS10.0分析，计量资料采用±s表示,多组之间比较采用方差分析,计数资料组间比较采用卡方检验,相关分析采用直线相关分析。

    2  结  果

    2．1  HPV16/E7的表达  14例声带息肉中有2例表达（14.3％），21例喉乳头状瘤中有14例表达（66.7％），14例喉鳞癌中有12例表达（85.7％）,差异有统计学意义(P＜0.01),（见图1）。

    2.2  Ki67的表达  Ki67染色的细胞在声带息肉中仅散在的表达于细胞的基底层(图2A);在喉乳头状瘤中阳性细胞逐渐增多散在分布于基底层、棘细胞层或整个上皮,基底层细胞较声带息肉多(图2B)；在喉鳞癌中阳性细胞表现为核的多型性、核染色质丰富、核浆比例增大及异常的核分裂相且表达数目明显增多，并延伸到上皮中层(图2C)。

   2.3  CD34的表达  声带息肉中血管管壁完整，血管一般不密集分布(图3A);喉乳头状瘤中血管有不完整的血管壁出现,血管有成簇出现的现象(图3B)；喉鳞癌中血管管壁不完整，数目明显增多，可见部分单个内皮细胞聚集成簇(图3C)；再者在三种病变组织中间质新生血管的形态也随细胞增殖活化程度的不同而不同，声带息肉和喉乳头状瘤间质新生血管横断面多为圆形、椭圆形，相对比较规则(图3A, 3B)；而喉鳞癌间质新生血管的形态多为不规则形扭曲、扩张及分叉，边缘变锐(图3C)。Ki67在声带息肉、喉乳头状瘤、喉鳞癌组织中的阳性表达 (SP，×200)

    2.4  HPV/E7、Ki67、CD34的表达及其之间的关系  图像分析结果(表1)显示, Ki67、CD34在三种组织中的阳性表达呈逐渐递增的趋势,组间差异有统计学意义(P＜0.01)；Ki67与MVD呈正相关(r=0.878)；HPV16/E7与Ki67呈正相关（r＝0.854）。

　   3  讨  论

    HPV作在喉乳头状瘤和喉癌的发生中的作用［3］日益受到重视，对喉乳头状瘤、喉鳞癌中的HPV16/E7进行检测，有助于进一步认识HPV在喉癌的发病的生物学机制，为最终预防及治疗HPV 引起的喉乳头状瘤、喉鳞癌提供理论指导。已鉴定出的120余种HPV中HPV16属高危型，E基因有7个，E6和E7基因与细胞转化有关，激活与肿瘤的发生、发展有关。HPV能合成一系列蛋白质，包括自身结构蛋白(衣壳蛋白)和致癌蛋白(E2、E6、E7等转录因子)。这些致癌蛋白干扰正常细胞的调控，导致组织细胞异常增生、遗传变异和转化［4］，最终引起癌变。本研究发现,在声带息肉、喉乳头状瘤和喉鳞癌中HPV/E7的表达与细胞的恶性度和增殖活性明显相关。因此,检测HPV16型的E7蛋白可直接反映HPV的复制和转录的活化状态，可作为成人喉乳头状瘤癌变的生物标志物。

    Ki67是一个和细胞增殖有关的核抗原，与细胞的增殖密切相关，Ki67抗原是Gerdes等人［5］于1983发现的一种双链非组蛋白分子，分子量为345?kD及395?kD，包含有200个以上的磷酸化部位。在细胞周期中，除G0期外，在G1、S、G2、M期Ki67均有表达，其半衰期很短，能较全面可靠地反映细胞增殖活性［6］。Ki67与肿瘤良恶程度关系方面的研究结果基本一致，即Ki67指数与肿瘤恶性程度正相关［7］，肿瘤细胞分化程度越低，其增殖活性越高，预后越差，是判断肿瘤良恶程度、侵袭力和预后的重要标志之一［89］。喉乳头状瘤组织中Ki67的高表达预示喉乳头状瘤有癌变的可能。

    肿瘤生长、发展、恶变、侵袭依赖肿瘤新生血管的形成，如果肿瘤缺乏血管而营养供应不足，肿瘤就不会迅速增殖。一旦新生血管长入肿瘤组织，肿瘤细胞得到充分的营养供应，肿瘤组织就会呈现不可控制性生长及无限制扩张的趋势。CD34为高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白,与肿瘤的血管生成密切相关，已成为目前比较敏感的血管标记物，其抗体能突出显示较小的不成熟的微血管或单一的内皮细胞，且重复性好。肿瘤组织内的微血管形态、分布、数量等对判断肿瘤的生物学行为有着重要的意义，有研究［10］认为,早期肿瘤新生血管密度的增加预示肿瘤可能已进入一个快速增长、加速侵袭和恶变潜能增加的时期。本实验发现，CD34的表达与病变的细胞分化程度有关，而且在成人喉乳头状瘤中已有成簇的新生血管形成,反映了成人喉乳头状瘤易发生恶变的特性。

    Ki67和CD34从增殖活性和血管生成两个方面反映了肿瘤的特性，肿瘤的新生血管化促进了肿瘤细胞迅速大量的增殖，Ki67表达增高；肿瘤增殖时新生血管的生成增加，CD34的表达也增加。国外报道肿瘤组织中Ki67的表达和MVD水平呈正相关［11］。本实验表明,Ki67的表达与间质MVD呈正相关（r=0.878），共同反映了成人喉乳头状瘤增殖活性和易恶变的生物学行为，为喉乳头状瘤的诊断及预后判断提供了依据。                       

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