Ki67基因RNA干扰增殖型腺病毒对肺癌细胞增殖的抑制作用

　　作者：毛立军，郑骏年，郑宏祥，孙晓青，陈家存 作者单位：221002 江苏徐州医学院附属医院泌尿外科

　　【摘要】 目的 探讨Ki67基因小干扰RNA(Ki67siRNA)增殖型腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用及Ki67的表达情况。方法 提取重组腺病毒的DNA，PCR鉴定正确后，大量扩增，氯化铯梯度离心纯化，测病毒滴度。ZDKi67感染人肺癌细胞系(A549)，通过荧光显微镜下观察和结晶紫染色法检测细胞病作用、MTT法检测细胞存活、Western印迹法检测E1A、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Ki67表达。结果 PCR鉴定表明ZD55Ki67包含目的基因且无野生型腺病毒的污染;ZD55Ki67滴度为4.5×1010 PFU/ml;免疫印迹法证实ZD55Ki67在肿瘤细胞中表达E1A;ZD55Ki67抑制Ki67表达及肺癌细胞生长的作用显著优于AdKi67。结论 ZD55Ki67能够有效抑制Ki67基因的表达，降低肺癌细胞的增殖能力，为肺癌研究和抗肿瘤基因治疗提供新的策略。

　　【关键词】 腺病毒; Ki67基因; RNA干扰

　　基金项目：国家自然科学基金(30570385);卫生部科研基金(WKJ20052026)

　　Antitumor Effect of Replicationcompetent Adenovirus Expressing Short Interference RNA Targeting Ki67 Gene on Lung Cancer

　　MAO Lijun，ZHENG Junnian，ZHENG Hongxiang，SUN Xiaoqing，CHEN Jiacun

　　Laboratory of Urology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002，China　Corresponding Author: ZHENG Junnian，Email：zhengjunnian@sina.com

　　Abstract：Objective To investigate the antitumor effects of replicationcompetent adenovirus expressing short interference RNA targeting Ki67 gene (Ki67siRNA) and the expression level of Ki67 gene on lung cancer A549 cells in vitro. Methods The recombined adenoviruses(ZD55Ki67), extracted DNA, were verified by PCR. Viruses were propagated on HEK293 cells and purified by CsCI gradient according to standard techniques, and functional PFU titers were determined by plaque assay on 293 cells. The antitumor potential of ZD55Ki67 to A549 cells was evaluated by fluorescence microscopy、MTT assay and crystal violet dye method. The expression of E1A was also detected by Westblot. The effect of ZD55Ki67 on the Ki67 expression of A549 cells was detected by RTPCR. Results The analysis of PCR indicated the recombinant adenovirus ZD55Ki67 containing Ki67siRNA gene and without wild adenovirus. Functional PFU titers of ZD55Ki67 were 4×1010PFU/ml. Westblot analyses indicated ZD55Ki67 can express E1A in adenovirusinfected A549 cells. The expression of Ki67siRNA gene delivered by ZD55Ki67 is more effective to inhibit the proliferation and the Ki67 expression in mRNA levels of A549 cells than AdKi67 in vitro. Conclusion ZD55Ki67 can inhibit the expression of Ki67 gene and proliferation of lung cancer A549 cells. ZD55Ki67 could be a powerful tool in further investigations of Ki67 gene and a novel therapeutic strategy for lung cancer.

　　Key words：Adenovirus;Ki67 gene; RNA interference

　　0 引言

　　肺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率还将呈上升趋势。目前可以利用的治疗方法非常有限,疗效也很不尽人意。近年来,溶瘤病毒成为研究的热点，由于病毒在肿瘤细胞内特异性增殖 [1，2]，基因的表达量相应成千上万的提高，进一步提高对肿瘤的治疗效果。本研究将增殖型腺病毒和RNA干扰技术结合起来，通过针对肿瘤增殖基因Ki67的RNA干扰增殖型腺病毒，探讨肺癌基因治疗的新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　HEK293细胞、ZDEGFP由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠。携带Ki67siRNA复制缺陷型腺病毒AdKi67和携带Ki67siRNA的E1B55kDa蛋白缺失的增殖型腺病毒ZDKi67由本室构建并保存,文章已另行发表。人肺癌细胞系A549由本室保存。QIAampDNA Blood Mini试剂盒为德国Qiagene公司产品。E1A一抗、二抗为Santa Cruz公司产品。RNAgents Total RNA Isolation、Access RTPCR试剂盒为美国Promega公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ZD55Ki67的PCR鉴定

　　病毒感染24孔板细胞，待细胞病变后，收集细胞上清，抽提病毒DNA(病毒DNA的抽提按照QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书进行操作)。以ZD55Ki67病毒DNA当作PCR模板，分别检测重组腺病毒中是否插入目的基因和有无野生型腺病毒的污染。目的基因上游引物5′TCGTTTAGTGAACCGTCAGATC3′，下游引物5′ACACGGTCTCGTAGGTCAAG3′。鉴定野生型病毒的上游引物5′AGAGCCCATGGAACCGAGA3′，下游引物：5′CATCGTACCTCAGCTCCTTCC 3′。反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.2 ZD55Ki67病毒大量制备、纯化与滴度测定

　　将293细胞铺于30～40个10cm培养皿，每块板加入病毒50μl，待细胞全部病变后(4～7d)，收集病毒，CsCl高速梯度法纯化病毒，空斑计数法测定病毒滴度。

　　1.2.3 用相同滴度(MOI=5)的ZD55EGFP与AdEGFP(表达绿色荧光蛋白的非复制型病毒)感染A549细胞。分别于1d和5d在荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 结晶紫实验

　　将A549细胞低密度铺于24孔板，1d后分别用MOI(multiple of infection)为0、0.1、1、10、100的ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67病毒感染细胞，未处理的细胞作为阳性对照。37℃继续培养7d后，吸净培养基，每孔加入500μl结晶紫染色液染色15min,在净水中将多余的染液洗净，拍照。

　　1.2.5 细胞生长抑制试验

　　采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法:将MOI=0、0.01、0.1、1、10的ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染A549细胞,每个样本设3个复孔，分别在感染1、2、3、4d后加入MTT 20μl/孔(5mg/ml),继续培养4h后吸弃上清。加入二甲亚砜100μl/孔,溶解甲瓒紫结晶,490nm波长下测定A值，计算存活率 [存活率=实验组A值/对照组A值×100%]。

　　1.2.6 Western blot检测E1A蛋白表达

　　将A549细胞低密度铺于6孔板，一天后用MOI=10.0的ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染细胞，未处理的细胞作为对照组。48h后快速制备法提取核蛋白,经电泳、转膜后杂交,一抗为兔抗人E1A单抗,二抗为碱性磷酸酶偶联鼠抗兔多抗,以NBT/BCIP显色。以图象处理仪(Gene Company)分析处理,测定吸光度(A)并计算与空白对照组比值。

　　1.2.7 RTPCR检测Ki67 mRNA表达

　　将A549细胞低密度铺于6孔板，一天后用MOI=10.0的ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染细胞，未处理的细胞作为对照组。48h后提取总RNA,采用一步法行RTPCR反应。Ki67引物:正义链5′CTTTGGGTGCGACTTGACG3′,反义链5′GTCGACCCCGCTCCTTTT3′。反应条件：94℃30sec、50℃ 30sec、68℃ 60sec共进行40个循环。以GADPH基因作为内对照。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳,紫外照相并行扫描分析,以Ki67/GADPH表达水平行半定量分析。

　　1.2.8 统计学方法

　　采用方差分析,SPSS统计软件处理。

　　2 结果

　　2.1 ZD55Ki67鉴定和滴度测定

　　用ZD55Ki67病毒DNA作为PCR反应模板，反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可观察到在约500bp的位置有一条带,与作为阳性对照的pZD55Ki67相同,表明ZD55Ki67含有目的基因，见图1。以病毒DNA为模板，ZD55Ki67只在约900bp的位置有一明显条带，而作为对照的野生型腺病毒在约1150bp有一条明显的条带，证明ZD55Ki67没有野生型腺病毒污染，ZD55Ki67病毒构建成功，见图2。根据计算公式ZD55Ki67病毒滴度为4.5×1010PFU/ml。

　　2.2 ZD55EGFP、AdEGFP在肺癌细胞内复制情况比较

　　一天后，ZD55EGFP和AdEGFP感染的A549细胞中只有少数几个细胞显示出很弱的荧光蛋白表达。5天后在荧光显微镜下观察，也发现ZD55EGFP感染的A549细胞中，表达荧光蛋白的细胞数目显著增加，同时荧光强度也大大高于AdEGFP感染的细胞。

　　2.3 细胞毒性实验结果

　　ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染A549细胞后，对A549细胞均有杀伤作用。MOI=1时，ZD55Ki67可以将A549细胞全部杀灭，而达到相同杀伤效应ZD55EGFP的MOI值为10，AdKi67杀伤作用最弱，AdKi67在MOI值为10时只能将A549细胞部分杀灭(图略)。

　　2.4 MTT法检测结果

　　(1)用MOI=10的ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染A549细胞，4天后存活率分别为(15.5±0.6)%、(50.0±12.3)%、(85.4±14.2)%，见图3B，各组间比较差异有统计学意义。(2)感染4天后，MOI=0.01、0.1、1、10时ZD55Ki67处理组细胞存活率分别为(72.1±11.5)%、(68.1±9.7)%、(26.6±2.5)%、(15.5±0.6)%，见图3A。各组间比较差异有统计学意义(α<0.05)

　　2.5 Westblot检测结果

　　病毒ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染A549细胞48h后，ZD55Ki67组可以检测到E1A的表达,AdKi67处理组没有E1A的表达，见图4。

　　2.6 RTPCR检测结果

　　病毒ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67感染A549细胞48h后，Ki67mRNA表达分别是对照组的(33.5±1.2)%、(76.2±2.7)%、(57.2±1.2)%，各组间有统计学意义(α<0.01)，见图5。

　　1.阴性对照;2.AdKi67;3.ZDEGFP;4.ZDKi67

　　3 讨论

　　自从1996年，Bischoff [3]等报道腺病毒E1b55 kD蛋白缺失的突变株dl1520只在p53突变的肿瘤细胞内增殖，并有溶瘤作用，而在p53功能正常的非肿瘤细胞内这一作用减弱甚至消失以来，这种仅在肿瘤细胞中复制、增殖，并裂解肿瘤细胞的腺病毒(被称作选择性增殖腺病毒，CRAds)由于克服了复制缺陷型腺病毒载体转染效率低和治疗基因表达量低的难题，成为近十年兴起的一种肿瘤治疗新方案,现已进行了少量临床试验,其结果令人鼓舞 [37]。本研究中采用的ZD55Ki67病毒也是一种E1b55kDa缺失的增殖型腺病毒,与ONYX015不同之处在于其E1b55kDa基因缺失部位插入可以转录Ki67小发夹RNA的DNA模板基因。

　　RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由短的双链RNA诱发的基因沉默 [8]。RNAi干扰技术已经迅速而广泛地应用到基因功能及基因素达调控机制等领域,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景,也为基因治疗开辟了新的途径。Ki67基因是一细胞增殖相关基因,在肿瘤增殖各期均有表达，我们曾证实针对Ki67基因的小干扰RNA(siRNA)可有效抑制肾癌细胞Ki67表达，进而抑制增殖、促进凋亡，但作用短暂 [9]。我们构建的Ki67siRNA表达质粒，虽然作用时间有所延长，但也仅维持72小时 [10]。这些研究表明针对Ki67基因的RNA干扰有望用于肿瘤治疗，但需要更有效的载体。

　　关于CRAds介导RNA干扰的研究尚不多见，Carette JE等 [11]人构建了转录萤光虫素酶小发夹RNA的条件增殖病毒，但构建条件增殖病毒的机制与本实验有所不同，通过表达Ki67小发夹RNA的CRAds探讨对肺癌的治疗作用具有一定的创新意义。结晶紫实验表明MOI=1时，ZD55Ki67可以将A549细胞全部杀灭，而达到相同杀伤效应ZD55EGFP的MOI值为10，AdKi67杀伤作用最弱，AdKi67在MOI值为10时只能将A549细胞部分杀灭。病毒感染后4d在MOI=10时ZD55Ki67、ZD55EGFP、AdKi67处理组的肺癌细胞的存活率分别为(15.5±0.6)%、(50.0±12.3)%、(85.4±14.2)%，表明ZD55Ki67较ZD55EGFP、AdKi67杀伤作用明显提高。RTPCR检测显示ZD55Ki67组抑制Ki67蛋白作用较AdKi67组明显增强。本研究的成功，将为利用增殖型腺病毒介导Ki67siRNA靶向治疗肺癌提供新的工具。

　　【参考文献】

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　　[10]郑骏年,马腾骧,孙晓青,等. Ki67基因siRNA表达载体的构建、鉴定及功能研究[J]. 中华实验外科杂志，2005，22(5)：611613.

　　[11]Carette JE, Overmeer RM, Schagen FH, et al.Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells[J]. Cancer Res，2004，64(8):26632667.