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甲基化检测


一、实验原理

DNA甲基化存在于大多数真核生物中,一般发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶的5’UTR区,起调控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化,20%处于基因调控区的CpG岛中。

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。

BSP甲基化测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR)的原理通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留,我们将扩增得到的PCR产物进行TA克隆测序,可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高,是甲基化检测的金标准。


二、 应用简介

在恶性肿瘤的发展中,甲基化的状态并不是一成不变,肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系,DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。


三、 实验方法


四、 样本送检要求



五、案例展示



六、常见问题

1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;

2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。

3、验证提取DNA的纯度的方法有二:紫外分光光度计计算OD比值;2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。第二种方法可以完全明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。

4、基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。

5、所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。

6、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

7、水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。 

8、在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用。 

9、乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出。

10、异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便。 此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了。  

11、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

12、凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性。

13、紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤。 

14、回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的。   

15、涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上; 

16、不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个。 

 


七、服务流程

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