γ射线辐照对β淀粉样肽诱导红细胞膜损害的作用

　　作者：曹媛,张献清,齐浩,曾成鸣　　作者单位：陕西师范大学：化学与材料科学学院，生命科学学院，陕西 西安 710062，第四军医大学西京医院输血科，陕西 西安 710033

　　【摘要】目的： 研究γ射线辐照对β淀粉样肽(Aβ)诱导的红细胞膜损害的保护作用. 方法： 红细胞经50 Gy和100 Gy γ射线照射后，再用Aβ处理，分别用分光光度法测定红细胞溶血率和渗透脆性;扫描电镜观察细胞形态;1,6二苯基1,3,5己三烯(DPH)荧光探针标记检测细胞膜流动性. 结果： γ射线辐照可抑制红细胞的自然溶血和Aβ导致的溶血，但只有100 Gy辐照的差异具有统计学意义(P<0.05)，使自然溶血率和Aβ引起的溶血率由(3.76±0.50)%，(11.90±1.50)%分别降至(1.87±0.09)%和(7.90±0.90)%. 50 Gy和100 Gy的辐照均可降低Aβ引起的细胞变形程度，增加细胞膜的流动性(P<0.05)，荧光探针的各相异性值由0.36±0.01分别降至0.33±0.00和0.32±0.01，并提高红细胞对低渗溶液的耐受性，50%溶血时的NaCl浓度由82.3 mmol/L分别降至80.7 mmol/L和76.9 mmol/L. 结论： 在本实验条件下，γ射线辐照可降低Aβ对红细胞膜的损伤，并可增加红细胞膜的流动性及稳定性.

　　【关键词】 γ射线,淀粉样β蛋白, 红细胞,溶血,膜流动性

　　0引言

　　低剂量γ射线辐照(<1 Gy)可刺激机体的免疫功能，提高机体的抗病能力[1]. 目前，临床上常用15~35 Gy的γ射线对血液进行辐照，灭活血液中的淋巴细胞，以预防输血相关的免疫疾病[2]. 该剂量范围的γ辐射对血液中的其他成分也可产生一定的影响[3-4]. 红细胞在经400 Gy辐照后，短时间内可增加细胞的稳定性[5]. 本研究采用小于100 Gy的γ射线处理红细胞，以β淀粉样肽(βamyloid peptide, Aβ)诱导红细胞膜损害为实验模型，研究此剂量范围的辐射对红细胞某些性质的影响，以及对Aβ的细胞毒性的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料新鲜全血取自健康志愿者，枸醛酸抗凝;Aβ和荧光探针1,6二苯基1,3,5己三烯(diphenylhexatriene, DPH)(美国SigmaAldrich公司);其它试剂均为国产分析纯. 1240型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司);LS55型荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司);3k30型冷冻离心机(美国Sigma公司);Gammacell R 1000型血液辐照仪 (加拿大Nordian公司);Quanta 200型环境扫描电镜(荷兰PhilipsFEI公司).

　　1.2方法

　　1.2.1红细胞的制备和辐照处理取新鲜全血750 g，4℃离心10 min，吸去上层血浆和白细胞，并用等渗PBS(150 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4)洗涤3次,制备成200 mL/L细胞悬液，然后用γ射线照射，照射剂量分别为0，50和100 Gy.

　　1.2.2红细胞溶血率的检测照射过后的红细胞悬液用等渗PBS稀释至20 mL/L，加入Aβ使其终浓度为5 mg/L，37℃水浴30 min后取出，750 g，4℃离心10 min，取上清， 540 nm处测出吸光度值A1;沉积红细胞用蒸馏水全溶血后离心，用同样方法测得吸光度值A2. 按下式计算溶血率：溶血率(%) = A1/(A1+A2)× 100%.

　　1.2.3扫描电镜观察红细胞形态处理过的红细胞经终浓度为10 g/L戊二醛固定，用500，700，900，1000 mL/L丙酮系列脱水，喷金后进行扫描电镜观察.

　　1.2.4红细胞的渗透脆性测定红细胞分为未照射组，50 Gy照射组和100 Gy照射组. 配制不同渗透压的PBS，其中NaCl的浓度为0~135 mmol/L，在上述PBS中分别加入各组红细胞悬液，细胞终浓度为2 mL/L，37℃水浴30 min，取出后以1.3.2中的方法分别测溶血率，以NaCl浓度分别为135 mmol/L和0 mmol/L的PBS为对照和全溶血对照，计算50%溶血时的NaCl浓度.

　　1.2.5红细胞膜流动性的检测用四氢呋喃作溶剂配制2×10-3mol/L的DPH储存液,于棕色瓶中4℃低温保存. 工作液浓度为5×10-5mol/L,临用前用等渗PBS稀释. 红细胞用等渗PBS稀释至2 mL/L浓度，与DPH工作液等体积混合，于37℃水浴孵育45 min后，检测偏振荧光(激发光波长为362 nm，发射光波长为450 nm).

　　统计学处理： 用SPSS10.0统计软件进行处理，实验数据以x±s表示，多个样本均数比较采用方差分析及t检验.

　　2结果

　　2.1红细胞的溶血率在未经辐照处理的情况下，等同实验操作可使红细胞发生少量溶血(溶血率<4%)，而在红细胞经γ射线照射后，自然溶血率随着辐照增加而降低，在100 Gy时自然溶血率由(3.76±0.50)%降至(1.87±0.09)%，差异具有统计学意义(P<0.05). 加入Aβ后可导致红细胞溶血率增高至(11.90±1.50)%(P<0.01)，红细胞经γ射线照射后，Aβ导致的溶血作用降低，50 Gy照射组虽低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，而100 Gy辐照则使Aβ的溶血作用降低至(7.90±0.90)%，其差异具有统计学意义(P<0.05).

　　2.2红细胞形态未经γ射线辐照的红细胞，Aβ处理后形态发生明显改变，部分细胞出现棘突，并伴随有细胞的轻度聚集;经过γ射线照射后，Aβ处理的红细胞中变形的细胞比例减小，聚集程度相对降低，形态维持较好. 说明γ射线照射对红细胞维持正常形态有一定的作用(图1).

　　A: 对照组; B: 未加入Aβ，辐照剂量为50 Gy; C: 未加入Aβ，辐照剂量为100 Gy; D: 未经辐照处理的RBC加入Aβ; E: 加入Aβ，辐照剂量为50 Gy; F: 加入Aβ，辐照剂量为100 Gy.

　　2.3红细胞的渗透脆性红细胞的渗透脆性反映了细胞对低渗溶液的耐受性. 经过γ射线照射的红细胞与未照射组相比较，细胞膜的渗透脆性有下降趋势，未照射组，50 Gy和100 Gy照射组在50%溶血时对应的NaCl浓度分别为82.3 mmol/L，80.7 mmol/L和78.9 mmol/L，说明红细胞在这一渗透压范围内随着照射剂量的升高，其低渗耐受性有所提高，细胞膜在低渗环境下的稳定性增加.

　　2.4红细胞膜流动性偏振条件下DPH荧光的各向异性值可反映细胞膜的流动性，各向异性值越低，其膜的流动性越高. 实验结果显示，加入Aβ后各向异性值变化很小(P>0.05 )，说明Aβ几乎不影响细胞膜的流动性. 红细胞经50 Gy和100 Gy γ射线照射后，DPH荧光的各向异性值降低，50 Gy和100 Gy照射组与对照组(0.36±0.02)相比较分别降低至(0.29±0.01)和(0.26±0.01)，细胞膜流动性有所提高(P<0.05). 在加入Aβ的细胞中也呈同样的趋势，各相异性值50 Gy和100 Gy照射组与对照组(0.36±0.01)相比较分别降至(0.33±0.00)和(0.32±0.01).

　　3讨论

　　γ射线的生物学效应与其剂量有关. 在本研究的实验条件下，经50 Gy和100 Gy两个剂量的γ辐照处理之后，红细胞的自身溶血作用和Aβ诱导的溶血作用均有所降低，说明该剂量范围的γ辐射具有稳定细胞膜的作用. 细胞正常形态的维持依赖于细胞膜及膜骨架的支持，因此细胞形态可以反映细胞膜的结构和稳定性的变化. Aβ作用于红细胞后，部分红细胞发生棘突，形态改变，增加了膜融合和形成非专一性离子通道的可能性. 这提示Aβ的溶血作用与细胞膜的损害有关. 而γ辐射能够降低这种损害作用，使红细胞维持正常的形态，减小了Aβ的溶血作用. 我们认为，γ辐射的这种作用除了与膜蛋白的构象变化有关以外，还在一定程度上与细胞膜的流动性增加有关. 已有研究[6]表明，Aβ的细胞毒性的分子机制之一是Aβ通过在膜上的自聚集而形成非专一性离子通道，从而破坏细胞膜结构. 当膜的流动性降低时，如增加膜中的胆固醇含量或者减少不饱和脂肪酸的比例等，Aβ对细胞膜的损害会增强[7]. 这与本研究中γ辐照增加细胞膜流动性，同时降低Aβ诱导的膜损害的结果是一致的. 值得指出的是，经γ辐射处理的红细胞，仅在数小时内具有抑制Aβ溶血的作用.

　　综上所述，在一定的剂量范围内(30 Gy~100 Gy)的γ辐射能够降低Aβ导致的红细胞损伤. 通过对50 Gy和100 Gy两个辐照剂量的比较发现，100 Gy辐照的保护作用更强. 这两个剂量的辐照能够提高细胞膜的流动性，使细胞维持正常形态. 这些结果为进一步研究Aβ的细胞毒性机制和γ辐射对细胞的作用提供了依据.

　　【参考文献】

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　　[3] Jacobs GP. A review on the effects of ionizing radiation on blood and blood components [J]. Radiat Phys Chem, 1998,53:511-523.

　　[4] Hirayama J, Abe H, Azuma H, et al. Leakage of potassium from red blood cells following gamma ray irradiation in the presence of dipyridamole, trolox, human plasma or mannitol[J]. Biol Pharm Bull, 2005,28:1318-1320.

　　[5] Krokosz A, SzwedaLewandowska Z. Induction of transient radioresistance in human erythrocytes [J]. Radiat Phys Chem, 2006,75:967-976.

　　[6] Murphy RM. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins[J]. Biochim Biophys Acta, 2007,1768:1923-1934.

　　[7] Gorbenko GP, Kinnunen PKJ. The role of lipidprotein interactions in amyloidtype protein fibril formation [J]. Chem Phys Lipids, 2006,141:72-82.