人肝癌组织父系表达基因10印记状态与差异性DNA甲基化区甲基化状态的关系

父系表达基因10(PEG1)是一个新的父系表达的遗传印记基因,在大多数肝癌组织中有表达,与肝癌发生和发展密切相关。大多数肝癌组织存在PEG10印记异常,主要表现为双等位基因同时表达的印记丢失"。差异性DNA甲基化区(DMR)的甲基化状态与印记调控密切相关。

一、材料与方法

1,组织标本:40份肝癌及其癌旁组织标本来自广西医科大学第一附属医院肝胆血管外科标本库,其所属患者中男36例,女4例,年龄29~76岁,平均(47.3±11.7)岁。每份组织标本均经病理检查证实。

2.PEG10基因型分析:通过DNA PCR产物测序法从肝癌组织标本中挑选出PEG10杂合子标本。按通用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司说明书提取40份肝癌组织基因组DNA。应用软件设计并合成针对PEG10基因单核苷酸多态性(SNP)位点的PCR引物。扩增片段长度为353bp,含3个SNP位点,。取DNA样品进行PCR扩增。PCR产物送上海英骏生物技术有限公司完成纯化和测序。当3个SNP位点中任一位点为杂合时,该组织标本即为PEG10杂合子样本。

3,等位基因表达分析:通过检测分析PEG1O杂合子肝癌组织及癌旁组织标本的PEG10mRNA表达水平,明确PEG10印记状态。按TRIzol试剂(美国Gibco公司)说明书步骤提取PEG1O杂合子组织标本总RNA。取RNA模板4u1,按照RT PCR试剂盒(美国Inxltlogen公司)说明书反转录合成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增PEG10基因,PCR产物测序。若SNP位点为单峰,表明该样本为单等位基因表达,判为印记存在。若SNP位点为杂合峰,表明该样本为双等位基因表达,判为印记丢失。无PCR产物亦判为印记丢失。

4.甲基化状态检测:按重亚硫酸盐修饰试剂盒,说明书对PEG10杂合子组织标本的DNA进行重亚硫酸盐修饰。将转化后的DNA纯化。应用Methyl Phmer Express软件,针对P军G10DMR两侧不含CpG位点的区域设计引物并进行PCR。PCR产物测序,CpG位点胞嘧啶(C)保持不变即表示该位点发生了甲基化。

5.统计学处理:采用SPSS12.0软件进行统计分析。计量资料以Ι±“表示,组间比较采用方差分析。P2.PEG10DMR的甲基化状态:在PEG10DMR扩增片段包含的25个CpG二核苷酸位点中,PEG10印记丢失、PEG1o印记存在的肝癌组织以及不表达PEG1O的癌旁组织PEG10D小/R发生甲基化的CpG位点数分别为(23.38±O27)、(7,12±0,61)、(2.69±O。49)个。前二者间比较差异有统计学意义(F=505.70,P<0.05),后二者间比较差异无统计学意义(F=2.25,P)005)。所有标本DMR甲基化状态均无等位基因差异。

讨论

DNA甲基化参与基因印记状态的调控,每个印记基因簇至少存在1个DMR,该区域的甲基化状态与印记调控密切相关。小鼠PEG10所处的基因印记簇中至少存在1个DMR,它位于PEG10及印记基因SGCE启动子区域内⒋。在人类胚胎及胎盘中,PEG10和SGCE DMR表现为母系等位基因甲基化、父系等位基因非甲基化,DMR以外的启动子区域CpG位点均呈非甲基化状态,提示父系等位基因表达而母系等位基因印记系DMR甲基化调控所致。本研究中,PEG10DMR发生甲基化的CpG位点数由少到多依次为癌旁组织、单等位基因表达的肝癌组织、双等位基因表达的肝癌组织,提示印记变化与DMR甲基化间似有关联。但有3例表现为印记存在的PEG10DMR甲基化,其相应癌旁组织呈双等位基因不表达,所以这种印记存在和双等位基因表达的印记丢失同样属于印记异常改变。因无亲本资料,本研究无法确认是父系表达而母系印记恢复.还是新形成的父系印记母系表达。若“DMR甲基化调控印记状态”的推测成立,那么这3例印记存在的肝癌组织PEG10DMR应一个等位基因甲基化,另一个等位基因非甲基化,但本研究中所有标本的等位基因PEG10DMR甲基化状态均一致,DMR甲基化状态与等位基因表达间并无对应关系,说明虽肝癌PEG10DMR甲基化水平明显升高,但它与印记调控并无必然联系。上述推断仅基于2种参数的测定并参考既往研究,尚需后续研究提供更强的证据支持。

参考文献

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