绿茶多酚对帕金森病小鼠多巴胺能神经元保护作用研究

帕金森病(Parkinson′ s discase,PD)是中老年常见的神经系统退行性疾病,其复杂的病因和发病机制至今尚未阐明,更无有效的治疗手段,在早期如何通过一系列的干预手段预防或延缓PD的发生、发展具有重大意义[1-2]。目前倾向于认为氧化应激水平的提高是PD重要的病理生理机制之一[3-5]。绿茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)是一种抗氧化剂,GTPs是绿茶中所提取的多酚类化合物,含丰富的儿茶素,其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)含量最多,占儿茶素含量的50%~60%,被认为是GTPs的主要活性物质,具有抗氧化、清除自由基的积极作用[6-7],在许多神经变性疾病中如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)显示出神经保护作用[8-10]。本研究以神经毒素1-甲基-4-苯基1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4- pheny1-1,2,3,6-tctrahydropyridine hydrochlohde,MPTP)注射C57BL/6J小鼠建立PD模型,研究 GTPs是否存在对PD多巴胺能神经元的保护和修复作用并进一步探讨其可能的作用机制。

 1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性C57BL/6J小鼠,SPF级,6~8周龄,60只,体质量20~25g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)20090004;饲养条件:桂林医学院SPF级实验动物饲养室,许可证号:SYXK桂2007- 0001。饲以实验动物中心提供的饲料(成分为大米粉、玉米粉、鱼粉等)。自由摄食、饮水,适应环境1周后进行实验。实验室温度25~28C,通风、自然采光。

1.2 主要试剂 GTPs由浙江东方茶业科技有限公司提供, 生产批号为20070518,GTPs纯度100%,其中EGCG含量为70.75%。MPTP购自Sigma公司。兔酪氨酸羟化酶抗体 (TH)由Blowor1d公司提供,超氧化物歧化酶(stlpe1oxide dis-mutasc,SOD)和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒均购自南京建成公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 动物分组 实验动物随机分成预防组、MPTP组、治疗组和空自对照组各15只。MPTP组:每天上午腹腔注射MPTP 30mg/kg体质量,每天1次,连续7d;GTPs干预方式为在小鼠饮水中掺人GTPs,含量为0.1%(W/V)。预防组:注射 MPTP前3个月开始GTPs干预至MPTP处理后3个月。治疗组:MPTP处理后开始GTPs干预3个月。空白对照组:腹腔注射同体积的生理盐水,连续7d,饮水中未加人GTPs,余处理方法及时长同治疗组。

1.4 黑质多巴胺能神经元计数 各组动物按分组处理方式结束后5d各取7只进行免疫组织化学方法测定黑质多巴胺能神经元数目。麻醉动物后以4%多聚甲醛经心灌注,断头取脑后固定,常规脱水,石蜡包埋,连续冠状切片(片厚4um)后行 TH染色:二甲苯梯度脱蜡,无水乙醇,95%乙醇,蒸馏水进行水化处理,0.01M磷酸盐缓冲液(phosphate buffer soludon, PBS)洗3次,切片甩干,用免疫组织化学专用油笔在脑切片周围画圈,3%过氧化氢室温孵育30min;0.01M PBS洗3次;加封闭液室温20min,加TH(1:200)4℃过夜;0.01M PBS洗3次；加二抗(1:200)室温,2h孵育;0.01M PBS洗3次;加链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(1:100),室温1h。DAB 液显色3~10min;PBS终止反应;苏木素复染5min;梯度乙醇脱水,中性树脂封片。

1.5 SOD和MDA含量测定 4组动物按分组处理方式结束后5d各取8只进行SOD和MDA含量测定。小鼠迅速断头取脑,冰上分离中脑腹侧组织,吸干称重后置于匀浆器内充分匀浆,低温14000r/min离心30min,参照试剂盒说明书分别测定氧化应激标志物SOD和过氧化物MDA含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学数据分析,计量资料以 x± s表示,组间比较采用方差齐性检验、莎检验和t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1 黑质多巴胺能神经元计数 空白对照组、预防组、治疗组及MPTP组TH阳性细胞计数结果分别为(249.0± 32.70)、 (214. 0± 26.50)、(198.0± 30.90)和(156.0± 28.20)个/视野。预防组、治疗组及MPTP组与空白对照组比较,TH阳性细胞明显减少(P<0.05),见图1。预防组、治疗组、MPTP组减少率依次增高(P<0.05),见图2。

2.2 SOD和RIDA含量测定结果MPTP组、预防组和治疗组SOD含量均较空白对照组降低,而MDA含量则相反,荃组SOD 和MDA变化的幅度比较差异有统计学意义,见表1和图3。

3讨 论

本研究以MPTP诱导C57BL/6J小鼠建立PD模型[11],并用GTPs进行干预,发现GTPs能够减轻MPTP造成的黑质多巴胺神经元的丢失,降低SOD及提高MDA含量和活性,增加抗氧化能力,尤其是在造模前使用GTPs干预的预防组各个指标均优于GTPs后处理的治疗组。

PD是与衰老密切相关的神经系统退行性疾病,其特征性病理变化为黑质多巴胺能神经元的大量变性,缺失达到6O% ~80%含量时就会出现典型的运动症状[12]。本实验应用 GTPs干预后证实,GTPs能够减少多巴胺能神经元的缺失,起到保护作用,而在损伤前进行预防性用药则能达到更佳效果。 PD发病机制至今不甚明了,但是,随年龄增长同时升高的氧化应激含量已为大多数学者所关注和认同[13]。SOD和MDA等抗氧化指标的测定是研究氧化应激含量的常用手段。GTPs 的重要活性成分是EGCG),后者主要以原型存在于血液和靶器官中,且能够通过血脑屏障渗人神经系统[14] ,成为其发挥神经保护作用的前提。预防性使用GTR,将整体内环境包括神经系统在内的抗氧化能力和清除自由基的功能在病变之前先提升到更高水平[15],同时促进内源性抗氧化酶如SOD的生成, 从而提高发生病理改变的阈值,在同等的致病条件下能降低被损伤程度和范围,最大限度地保护包括黑质多巴胺能神经元在内的神经系统,其效果远远大于病变之后的治疗性用药的神经修复作用。GPTs通过抗氧化、抗炎等广泛的生物活性途径起到神经保护作用,作为防治PD和其他神经系统退行性疾病的潜在性药物,具有良好的应用前景。

参考文献

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