西维来司钠对高原颅脑损伤大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶的影响及神经损伤的保护作用

作者：马铁军1，周其全2    作者单位：(1.第三军医大学学员旅七队， 重庆 400038;2.第三军医大学高原军事医学系高原疾病教研室， 重庆 400038) 　　【摘要】  目的 探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对大鼠高原颅脑损伤的影响及NE抑制剂西维来司钠对高原颅脑损伤的神经保护作用。方法 取雄性SD大鼠48只，随机分为6组。即平原对照组，平原颅脑创伤组，平原颅脑创伤+西维来司钠治疗组，高原对照组，高原颅脑创伤组，高原颅脑创伤+西维来司钠治疗组。创伤组按Feeney自由落体撞击法制作大鼠高原与平原颅脑损伤模型，对比观察高原与平原颅脑创伤前后以及给予西维来司钠治疗后血清NE浓度变化，并通过病理学观察西维来司钠治疗对高原颅脑损伤的神经保护作用。结果 大鼠高原颅脑创伤前后NE浓度均明显高于平原颅脑创伤前后(P<0.05)，脑组织病理形态结果显示，高原大鼠颅脑创伤后立即给予NE抑制剂西维来司钠治疗，颅脑损伤程度较未治疗组明显减轻。结论 NE是加重大鼠高原颅脑损伤后神经组织损伤的重要因素，西维来司钠治疗对高原颅脑损伤的神经组织具有明显的保护作用。

　　【关键词】  颅脑损伤;弹性蛋白酶;西维来司钠;神经损伤;高原

　　AEffect of sivelestat on neutrophil elastase and neuroprotection in rats with

　　craniocerebral injury at simulated high altitude

　　MA Tiejun,ZHOU Qiquan

　　(Seventh Student Team,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

　　Abstract： Objective To investigate the effects of neutrophil elastase(NE) in traumatic brain injury and neuroprotective effect of sivelestat in rats at simulated high altitude.Methods Totally 48 adult male Wistar rats were divided into plain group and plateau group,and then subdivided into control group,craniocerebral injury group and craniocerebral injury+sivelestat therapy group in both groups respectively.The model of traumatic brain injury at both simulated high altitude and plain was made by Feeney’s method.The level of NE before and after the craniocerebral injury between plateau group and plain group was observed and the diversity of NE between the two groups after the treatment was analyzed by injecting sivelestat.The neuroprotective effect of sivelestat at the simulated high altitude group was observed in pathobiology.Results The levels of NE before and after injury in plateau groups were obviously higher than those in the plain groups(P<0.05).HE dying of the brain showed that sivelestat had the neuroprotective effects in craniocerebral brain injury at simulated high altitude.Conclusion NE is an important factor in traumatic craniocerebral injury at simulated high altitude,and sivelestat has an obvious neuroprotective effect in traumatic craniocerebral injury at simulated high altitude.

　　Key words:craniocerebral injury;elastase;sivelestat;nerve injury;plateau

　　颅脑损伤是高原地区常见的神经外科急症，由于受高原严寒低氧、低气压等恶劣环境影响，患者病情危重，病程进展快，以致高原颅脑损伤致残率及病死率均明显高于平原地区。研究表明，中性粒细胞弹性蛋白酶(netrophil elastase,NE)在颅脑损伤后表达水平增高，且与损伤程度成正比，并加重颅脑损伤[1]。为此本研究拟探讨NE是否为高原颅脑损伤病情迅速恶化的重要因素，以及给予NE抑制剂治疗后是否对高原颅脑损伤具有保护作用，以便为高原颅脑损伤的救治寻求有价值的治疗措施。

       材料与方法

　　1 动物及分组

　　取健康雄性SD大鼠48只，体重200～240g，由第三军医大学动物实验中心提供。随机分为平原组和高原组。平原组和高原组再分别随机分为对照组、颅脑创伤组和创伤治疗组，每组8只。

　　2 平原大鼠颅脑创伤模型制备

　　采用Feeney法制备自由落体颅脑损伤模型。撞杆头端直径3mm，击锤重20g，下落高度20cm，落体致伤的冲击力为20g×20cm。动物称重后腹腔注射10%乌拉坦(15ml/kg)，麻醉后固定大鼠头部，沿正中线切开头皮并剥离骨膜，用颅骨钻于人字缝后2mm、中线右旁2mm处钻开直径4mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整。将撞杆头端置于骨窗处，击锤沿外周套管自由落下冲击撞杆，造成右后叶颅脑创伤。平原对照组大鼠为常压下随机抽取8只，不作创伤处理。

　　3 高原大鼠颅脑创伤模型制备

　　制备动物模型前3天将大鼠放入模拟海拔5000m低压氧舱内连续减压低氧3天，23h/d，1小时用于喂食、清洁氧舱。按平原大鼠颅脑创伤方法于第3天开舱时复制高原创伤模型，之后将大鼠继续放入5000m海拔高度减压24小时。高原对照组大鼠采取同样方法于低压舱内饲养3天，但不作创伤处理。

　　4 颅脑创伤后治疗

　　平原与高原颅脑创伤组大鼠创伤后，治疗组立即分别给予尾静脉一次性注射NE抑制剂西维来司钠150mg/kg(生理盐水溶解药物，药液总量控制在5ml/kg体重)治疗。非治疗组给予等容积的生理盐水。平原组与高原组动物分别于常压和减压状态下治疗24小时后，取股动脉血测定NE浓度和取脑组织做形态学观察。

　　5 NE浓度测定

　　平原对照组经股动脉取血2ml，高原对照组大鼠于5000m低压氧舱减压缺氧3天后取血，其他4组分别于颅脑创伤后24小时后取血，各组血液3000r/min离心分离血清，-70℃保存待测。采用双抗体夹心ELISA法测各组血清中NE浓度，标本中的NE与试剂盒NE单抗结合。加入生物素标记的抗大鼠NE(二抗)，形成免疫复合物辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)与二抗结合。最后加入四甲基联苯胺(TMB)显色，于OD值450nm测定NE浓度。

　　6 病理学检查

　　平原、高原颅脑创伤组与对应的颅脑创伤治疗组大鼠取血后立即处死，解剖取脑组织标本置于10%甲醛中固定。以创伤灶为中心取材，常规石蜡包埋，苏木素伊红(HE)染色光镜下观察。

　　7 统计学处理

　　数据应用软件Spss13.0分析结果，两组间资料统计采用两样本t检验，计算P值得出结论，P<0.05为差异显著，有统计学意义。

        结 果

　　1 高原与平原颅脑创伤后血清NE的浓度变化及西维来司钠对其的影响

　　结果所示，平原与高原组大鼠各自进行组内比较：颅脑创伤组大鼠NE水平均较对照组大鼠明显升高(P<0.05)，而静脉给予NE抑制剂西维来司钠会有效抑制NE释放(P<0.05)。同时，平原与高原两组间进行比较：对照组大鼠高原暴露下NE水平比平原暴露下NE水平高(P<0.05)，颅脑创伤组大鼠高原暴露下NE水平也比平原暴露下NE水平高(P<0.05)(见表1)。

　　2 高原颅脑创伤大鼠给予西维来司钠治疗前后脑组织形态学变化

　　光镜下显示高原暴露下大鼠颅脑创伤后脑组织局部出血明显(图1)、有较多炎性细胞浸润，神经细胞明显水肿，核固缩较严重(图2)。创伤后立即给予西维来司钠治疗后见局部出血灶范围明显减少(图3)，神经细胞水肿和核固缩现象有所减轻(图4)，表明创伤后立即给予西维来司钠治疗能够一定程度上控制病变发展，改善大鼠脑组织病理变化。表1 平原与高原暴露下大鼠创伤前及创伤治疗前后NE浓度变化比较

　　讨 论

　　1 高原颅脑损伤重于平原与NE相关

　　1.1 高原环境暴露下机体NE水平高于平原 高原环境的主要特点是低压低氧，机体处于这种环境下三磷酸腺苷(ATP)被迅速耗竭，细胞Na+/K+泵和Ca2+泵功能不能维持，生物膜的完整性和离子梯度遭到破坏，造成细胞严重损伤或死亡。文献报道，在大鼠异体心脏移植动物模型研究中，给予大鼠静脉持续输注NE抑制剂西维来司钠10mg/kg可使大鼠心肌的ATP含量降低明显低于对照组[2]，这就间接证明NE可以增强有氧代谢，产生更多的ATP。表明高原缺氧初期能代偿性的增高NE水平以提高机体抵御缺氧的能力，降低机体损伤。也有研究表明NE可作为抗炎症反应的重要指标在高原环境暴露下迅速升高，并且敏感程度较高[3]。

　　1.2 高原颅脑创伤后NE水平明显高于平原颅脑创伤

　　NE为中性粒细胞即多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)活化后释放的一种弹性蛋白酶。组织、器官损伤后，在白细胞介素8(IL8)、IL1、肿瘤坏死因子α(TNFα)等趋化因子作用下PMN向损伤部位浸润，释放出大量的NE进一步加重这些组织的损伤。高原低氧环境下，机体免疫调节功能紊乱，IL8、TNFα等作为NE最为关键的趋化因子参与了机体低氧应激过程而明显增高，结果导致NE水平的升高。因此，高原颅脑损伤后，中性粒细胞释放NE量相比平原颅脑损伤后会有所增加，本实验结果进一步证实了以上推论。

　　1.3 NE加重高原颅脑损伤的原因与机制

　　中枢神经系统的很多疾病都伴随着损伤局部及其周围组织的炎症反应，包括脑缺血、脑出血、脑组织炎症反应等。炎症作为一种对脑损伤的应答反应，会吸引更多的PMN向损伤区浸润。NE作为PMN活化后释放一种毒性分子在急性肺损伤中的作用已被肯定[4，5]，但NE在脑损伤中的作用较少报道，目前研究表明其参与颅脑损伤的机制主要表现在以下方面：(1)破坏血脑屏障增加血管壁通透性：颅脑损伤后的缺血/缺氧即可使脑微血管内皮细胞受损，血管通透性增加，进而使大量PMN黏附于血管内皮细胞，随后穿越血管内皮，在趋化因子的作用下，向损伤区募集，进而释放出大量NE，NE除直接破坏受损周围组织的神经细胞外，还可损伤血管内皮细胞、水解脑微血管内皮细胞外基质，从而破坏血脑屏障，增加脑微血管的通透性，加重脑水肿[6]。幺改琦等[7]通过PMN和血管内皮细胞体外共培养的方法，发现PMN释放的NE在PMN介导的内皮细胞损伤中起重要作用，抑制NE可以明显减轻这种损伤，这间接证实了NE可破坏血脑屏障。另一方面，NE通过抑制成纤维细胞生长因子(FGF)以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)从而抑制由于炎症所致的血脑屏障破坏后血管修复和再生功能[8]。NE的这种双重作用使血脑屏障破坏加重了颅脑损伤。(2)促进炎症细胞因子释放，加重脑缺血炎症反应;研究表明，NE可上调内皮细胞白细胞黏附分子1(VCAM1)、细胞间黏附分子1(ICAM1)及IL8的表达，促进PMN与内皮细胞间的黏附，进而向组织浸润，释放炎症递质。同时NE可以上调TNFα，TNFα的增加可促进IL6的合成和分泌，使炎症反应增强，增加血管内皮细胞通透性，导致渗出增加。而IL8与TNFα作为NE的关键趋化因子又可促进PMN的激活进一步释放NE，形成恶性循环，加重颅脑损伤后的炎症反应。

　　由此可见，高原环境下颅脑损伤发病急、病情严重、反应迅速，病死率明显高于平原，与高原环境下NE水平明显升高有关。而高原颅脑损伤后，NE的高阈值本身会迅速作用于损伤部位，并且上调相应炎症因子，促使PMN释放更多的NE以及相关蛋白水解酶加重组织通透性，使颅脑损伤后病情迅速恶化。

　　2 NE抑制剂西维来司钠的神经保护作用

　　NE作为一种毒性物质，参与弹性蛋白、Ⅳ型胶原、蛋白多糖等细胞外基质主要构成成分的降解过程使血管通透性增加，加重颅脑损伤。西维来司钠作为目前最有效的NE抑制剂，与内源性蛋白酶抑制剂相比，其抑酶活性不受机体释放活性氧的影响，可在炎症局部位置有效抑制活化的中性粒细胞对血管内皮细胞的损害作用，明显降低NE的释放[9]，因此有一定的神经保护作用。本实验结果进一步证实，高原颅脑损伤后NE水平明显高于平原颅脑创伤，给予西维来司钠治疗后不仅能有效降低血清NE水平，而且能有效地改善损伤部位神经损伤程度，减轻脑组织水肿，对神经组织起到明显保护作用。

　　NE作为神经保护作用的新靶点，其抑制剂西维来司钠可以降低高原颅脑损伤的病理程度及减少脑神经元的损伤。通过本实验研究证实，NE抑制剂用于高原地区颅脑损伤，可更有效的发挥其功能，具有较好的神经保护效应。

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