感觉神经肽P物质在损伤修复中的作用及分子机制

　　作者：赖西南    作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

　　【摘要】 为探讨感觉神经肽P物质（SP）在损伤修复中的作用，围绕感觉神经与修复进程中创面/伤口SP代谢的关系、SP在修复细胞表达生长因子及受体、表皮干细胞迁移、分化等方面的作用开展了研究。研究证实感觉神经释放的SP可上调成纤维细胞表达神经肽，诱导成纤维细胞表达生长因子及受体，调控表皮干细胞迁移、分化的作用，进入肉芽组织内的表皮干细胞可跨胚层向血管内皮细胞和成纤维细胞分化，提示感觉神经肽SP参与介导感觉神经调控损伤修复。

　　【关键词】  感觉神经肽 损伤修复 P物质

　　Effect of sensory neuropeptide SP on wound healing and its molecular mechanism

　　LAI Xinan

　　（State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Institute of Surgery Research,Daping Hospital，Third Military Medical University,Chongqing  400042，China)    　　Abstract：  To investigate the effect of sensory neuropeptide substance P(SP) on wound healing and related molecular mechanism.The research was carried out on the relationship between sensory nerves and metabolism of sensory neuropeptide SP in the wounds,the role of SP in  the expression of growth factors and those receptors by repair cells,and participation in migration and differentiation of epidermal stem cells.The results were as follows: SP released from sensory nerves in skin wounds upregulated neuropeptide expression of the fibroblast cells,induced  fibroblast cells to express some growth factors and those receptors,played an important role in migration and differentiation of epidermal stem cells,which can transdifferentiate into fibroblast or endothelial cells if the stem cells migrated into graduration tissue.The results suggest that SP as a mediator of sensory nervers participates in the regulation of wound healing.    　　Key words:sensory neuropeptide;wound repair;substance P

　　感觉神经肽为感觉神经元胞体合成的一类神经肽，包括P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、神经肽Y(NY)、K物质等，其中SP与损伤修复关系最为密切。组织损伤可刺激感觉神经末梢储存的SP进入损伤组织，与巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等免疫细胞的特异受体结合，通过刺激免疫细胞释放细胞因子，参与组织修复早期的炎症阶段的调控；SP与成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞细胞相应受体结合，可促进DNA合成和细胞增殖［1］。    　　由于感觉神经末梢释放的SP受内肽酶降解，半衰期仅数分钟，因而以往认为SP对组织修复的影响有限。近年来研究已证实，与组织修复有关的成纤维细胞、上皮细胞也可表达SP，损伤组织中SP含量变化与感觉神经纤维的数量以及愈合类型关系密切：在肉芽组织增生阶段，感觉神经纤维的数量和SP含量均高于肉芽组织成熟期；增生性瘢痕组织中SP含量高于正常皮肤或生理愈合的瘢痕组织［2］。因此，人们推测感觉神经释放的SP和组织细胞表达的SP存在某种联系，SP是周围神经调控组织修复重要因子。为了验证上述假设，作者所在的课题组对此开展了较深入的研究，本文报告其主要研究成果。

　　1  SP为介导感觉神经调控伤口愈合的重要细胞因子    　　以大剂量辣椒素化学毁损成年大鼠感觉神经后行皮肤全层切割伤（辣椒素组），免疫组化示肉芽组织细胞间隙、成纤维细胞和毛细血管周围SP、CGRP 免疫阳性染色明显弱于感觉神经正常组，伤后3天、9天，辣椒素组SP、CGRP免疫阳性染色的吸光度分别为感觉神经正常组53.23％、64.80％和42.70%、40%［3］。辣椒素组大鼠伤口愈合延迟明显，伤后12天伤口面积仍为感觉神经正常组的2倍，肉芽组织肌成纤维细胞标识物a肌动蛋白（aSMA）数量减少［4］。链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病大鼠的皮肤感觉神经Aδ类有髓神经髓鞘水肿、变性，无髓神经空泡样变性，微管、微丝排列紊乱，酶联免疫（ELISA）检测示皮肤SP含量仅为正常皮肤的24.64%～38.35%［5］。    　　胎兔损伤皮肤修复呈无瘢痕愈合,免疫组化示愈合皮肤SP、CGRP阳性染色数量低于成年兔。将已浸泡10-4mol/L SP的聚乙烯醇海绵放置于胎兔皮肤切口内，然后将胎兔送回子宫内，伤后7天剖腹取出致伤胎兔，见胎兔皮肤切口处有明显瘢痕形成；如胎兔皮肤切口内放置已浸泡生理盐水（SP溶剂）的海绵，愈合皮肤无瘢痕，镜下无明显纤维组织增生以及胶原沉积［6］。研究结果提示，胎儿皮肤无瘢痕愈合与SP低水平表达有关。

　　2  成纤维细胞、表皮干细胞SP表达受外源性SP调控    　　采用定量PCR、Western blot 、ELISA等方法证实表皮干细胞可表达SP。为了解感觉神经末梢释放的神经肽对修复细胞表达SP的作用，以SP（10-5～10-7mol/L）刺激体外培养的皮肤和增生性瘢痕的成纤维细胞、皮肤表皮干细胞，分别检测刺激前后细胞内SP 基因、蛋白表达和培养液中SP浓度。结果表明外源性SP刺激后，皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞SP mRNA水平和培养液中SP浓度均显著升高，刺激后24小时仍高于刺激前水平，皮肤成纤维细胞SP基因和蛋白表达的峰值时相较增生性瘢痕提前3小时［7］；SP刺激表皮干细胞后3小时，内源性SP基因和蛋白表达显著上调，分别在刺激后14小时和18小时达到峰值；阻断SP特异受体（NK1和NK2）抑制SP表达上调［8］。上述结果表明成纤维细胞、表皮干细胞表达SP受外源性SP的影响，提示在皮肤损伤时存在感觉神经末梢释放P物质可引起修复细胞“长时程”神经内分泌反应，这可能是损伤组织P物质含量高的重要原因。

　　3  SP可调控肉芽组织成纤维细胞表达生长因子及受体

　　3.1  SP调控生长因子及受体表达的量效与时效特征  以往研究已证实，SP可刺激免疫细胞释放生长因子，但对修复细胞的作用尚无报告。本研究发现大鼠皮下注射辣椒素50mg/kg毁损感觉神经1周后行皮肤全层切割伤，伤口肉芽组织SP免疫阳性染色减弱与表皮生长因子(EGF)及受体(EGFR) 、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)的基因表达抑制同步。不同浓度(10-9～10-5mol/L) SP作用于培养大鼠肉芽组织成纤维细胞，RTPCR、Western blot检测示SP可上调培养肉芽组织成纤维细胞表达EGF、FGF2、转化生长因子β1 (TGFβ1) 及其受体的基因和蛋白表达。调控生长因子与受体表达的SP浓度阈值不同，通常上调生长因子表达的SP浓度低于对相应受体上调的浓度，如上调成纤维细胞内源性EGFmRNA、EGFRmRNA表达的SP浓度分别为10-8～10-6mol/L和10-6～10-5mol/L,上调FGF2 和FGFR1 mRNA表达的SP浓度分别为10-9～10-5mol/L和10-6～10-5mol/L［9］。    　　采用上调上述生长因子及受体表达至峰值的SP浓度作用于成纤维细胞，观察作用后表达的时效关系。实验证实，SP作用后上述生长因子及受体mRNA表达大多持续至作用后6小时，蛋白质水平表达持续至16～24小时［9，10］。    　　上述研究结果提示，SP不仅有直接促进损伤修复的作用［1］，同时上调肉芽组织成纤维细胞表达生长因子与受体，“放大”SP的促修复作用；调控不同的生长因子与受体表达的SP浓度阈值不同。

　　3.2  成纤维细胞核因子NFκB激活是SP上调生长因子表达的重要通路  NFκB是存在细胞浆的快反应转录因子，调控众多的细胞因子和生长因子的表达，以凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测SP刺激后的成纤维细胞NFκB的DNA结合活性。研究发现10-7mol/L浓度SP作用30分钟，NFκB活性可达到峰值；SP特异的受体（NK1受体）阻断剂GR73632可阻断SP的刺激效应。SP对NFκB的活化可分别被抗氧化剂PDTC和钙离子拮抗剂BAPTAAM抑制，提示SP的活化作用可能是通过氧自由基和钙离子介导。采用NFκB硫代寡核苷酸圈套能明显抑制成纤维细胞FGF2表达，但对EGF表达无明显作用［11，12］。

　　4  SP在表皮干细胞迁移、分化中的作用及机制

　　4.1  SP是调控表皮干细胞增殖、迁移、分化的重要因子  采用STZ糖尿病大鼠模型，观察皮肤神经肽含量病理性减少对表皮干细胞增殖的影响，结果发现腹腔注射STZ后1周至4周，糖尿病大鼠皮肤SP含量与表皮基底层表皮干细胞标识物（β1整合素、K19）阳性染色细胞数均呈进行性下降，两者明显相关；STZ糖尿病大鼠创面局部应用SP，创缘及新生上皮β1整合素、K19阳性细胞数较对照组明显增加［13］。提示SP是维持表皮干细胞增殖的重要因子。    　　以往认为表皮干细胞的迁移、分化主要与细胞外基质成分的改变、细胞之间的接触、EGF、FGF等细胞因子的作用有关，对感觉神经肽的作用了解甚少。本研究利用干细胞核标记滞留的慢周期性，以5溴2尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)注射Wistar新生鼠，8周后行皮肤全层切割伤，观察伤口内BrdU和表皮干细胞标志物(K19、β1整合素)双重免疫阳性的细胞分布与伤口应用SP的关系［14］。研究发现皮肤全层切割伤后创缘与创面中每日注射SP(10-7mol/L，250μl)1次，伤后3天和5天分别在创缘和肉芽组织可见BrdU及K19、β1整合素免疫阳性细胞，表明表皮干细胞已迁移进入上述组织；未注射SP的大鼠创缘阳性细胞数明显少于注射SP的大鼠，肉芽组织也未见免疫阳性细胞。如以大剂量辣椒素预先毁损感觉神经后行皮肤切割伤，伤后3天创緣BrdU阳性数仅为未注射SP的大鼠的14.43％［14］。进一步研究表明，迁移入肉芽组织的表皮干细胞除可分化为成纤维细胞外，也可跨胚层分化为血管内皮细胞。此外，有文献报告，在损伤角膜局部，应用SP可诱导血液中骨髓间充质干细胞向损伤部位迁移，促进修复［15］。    　　为了解SP对表皮干细胞分化方向的影响，将10-7mol/L浓度SP加入表皮干细胞培养液中，加入后96小时，流式细胞仪检测示，89.7%的干细胞分化为整合素α6和CD71高表达的短暂扩充细胞，对照组无变化［16］。将SP分别加入BrdU标记的大鼠表皮干细胞（来源于表皮基底层）培养液中，注射干细胞混悬液于毛囊发育不良的裸鼠皮下，并在回植部位注射SP。注射干细胞混悬液28天后，加入SP的大鼠皮下毛囊数目明显较未加入SP的裸鼠增多，部份皮下毛囊的毛球、内外毛根鞘部位的细胞胞核中可见BrdU阳性染色，表明标记的表皮干细胞进入毛囊发育。如回植未加SP的BrdU标记表皮干细胞于裸鼠皮下，并且不在回植部位注射SP，回植部位不仅毛囊的数目少，且BrdU阳性颗粒仅存在于表皮层［17］。    　　上述结果提示，皮肤损伤修复时，感觉神经末梢以及修复细胞、免疫细胞释放的SP可发挥募集表皮干细胞向损伤部位迁移的作用，进入肉芽组织内的表皮干细胞可跨胚层向血管内皮细胞分化；皮下毛囊部位应用适宜浓度（10-6mol/L、10-7mol/L）的SP可促进毛囊发育，诱导来源于基底层的培养表皮干细胞进入毛囊代谢。

　　4.2  SP调控表皮干细胞分化的机制

　　4.2.1  NK-2受体是介导SP调控表皮干细胞分化的主要受体通路  在表皮干细胞培养液中加入SP和SP受体(NK1或NK2)阻断剂，培养96小时后用流式细胞仪检测整合素α6/CD71双标染色细胞，以了解表皮干细胞的分化状况。研究结果显示，以特异受体阻断剂阻断NK1受体时，未进入分化状态的表皮干细胞占22.6%，NK2受体阻断后，未进入分化的表皮干细胞占60.19%。提示SP刺激表皮干细胞进入分化状态主要通过NK-2受体介导［18］。

　　4.2.2  表皮干细胞βcatenin表达与SP促分化作用有关  βcatenin是启动表皮干细胞分化进程和方向的调控蛋白。10-7mol/L SP刺激培养表皮干细胞后，定量PCR和Western blot检测证实表皮干细胞βcatenin基因和蛋白表达上调。将BrdU标记的干细胞与SP（10-7mol/L）孵育后回植于裸鼠皮下，并在回植后4、7、10、14天在回植部位注射SP，28天后不仅见皮肤毛囊数增加，同时在毛囊外根鞘及毛球位置均可见BrdU和βcatenin免疫阳性表达细胞；如无SP刺激，BrdU阳性细胞仅出现在表皮，βcatenin表达弱，表明βcatenin表达上调是SP刺激回植表皮干细胞进入毛囊代谢的信号蛋白。对SP可上调表皮干细胞βcatenin表达的机制研究表明，SP与NK-2受体结合，继而激活CK1ε是激活βcatenin的主要途径［16］。

　　5  P物质在促皮肤伤口愈合中的应用    　　Wistar大鼠皮肤全层切割伤后，伤口注射SP（10-7mol/L,250μl，1/日），伤口闭合时间较未应用SP伤口提前3天［18］。STZ糖尿病大鼠皮肤全层切割伤后第1天至第3天，伤口注射SP(10-7mol/L，200μl)，肉芽组织羟脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量较未应用SP的伤口增加，伤口闭合时间提前1周［19］。    　　由于SP在体内易被中性内肽酶降解，半衰期短，为了提高SP的疗效，通过正交设计，制备了多囊脂质体，体外释药浓度在10-7～10-9mol/L之间，缓慢释放可达72小时。SP多囊脂质体注射于糖尿病大鼠皮肤创面，伤后愈合时间较空白脂质体组提前5天。    　　基于SP C末端6个氨基酸为其生物活性所必需，设计了SP的C端6肽，并对其酶切位置进行了羟基化化学修饰。以固相多肽合成技术合成的6肽SP应用于糖尿病大鼠皮肤创面，愈合时间较未用提前3天，显示改构6肽SP具有促愈活性。

　　6  小结    　　感觉神经肽SP是一功能复杂的小分子多肽，不仅存在于神经系统，成纤维细胞、内皮细胞、表皮干细胞等组织细胞也可表达。组织损伤时感觉神经末梢释放的SP启动神经免疫和神经内分泌反应，上调组织细胞SP自分泌，SP可刺激成纤维细胞表达生长因子及受体表达增加，参与调控表皮干细胞迁移、分化，进入肉芽组织内的表皮干细胞可跨胚层向血管内皮细胞和成纤维细胞分化。上述结果提示，感觉神经肽SP是介导感觉神经调控损伤修复的重要因子，调控P物质代谢可望成为促进损伤修复的新途径。

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