骨缺损基因治疗的研究进展

作者：瞿向阳,蒋电明    【关键词】  骨缺

   摘要:  基因治疗是修复骨缺损的主要研究方向之一。当前对骨缺损基因治疗的研究热点主要在于对骨诱导因子目的基因、各种载体及靶细胞的研究，将目的基因通过体内或体外途径转入靶细胞，维持骨诱导因子在局部持续有效地表达，从而修复骨缺损。本文就骨缺损基因治疗的实验研究和临床应用进展作一综述。

    关键词: 骨缺损;基因治疗;修复

    Advances in gene therapy of bone defect QU Xiang-yang，JIANG Dian-ming

    （Department of Orthopaedics，First Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400016，China）

    Abstract: Gene therapy is one of the main directions of restoring bone defect.Presently，the hot spot of research in gene therapy of bone defect rests mainlywith the gene of bone inducement factors、carriers and target cells.It transfers aim genes into target cells and maintains local continual efficient expression of bone inducement factors，which can restore bone    defect.We made a particular interpretation of the research progress in experiment research and clinical application.

    Key words:bone defect;gene therapy;restoration

    外伤、感染及肿瘤等疾病造成的骨缺损是矫形外科医师面临的一大难题。骨缺损导致骨折延迟愈合以及骨不连增加了病人的痛苦及治疗费用，还降低了其生活质量，对骨缺损治疗的研究已成为骨科领域的研究热点。骨的生长和修复受骨诱导因子的调控已被国内外学者所公认，但这些因子存在剂量难掌握、生物活性较低、半衰期短、所需的浓度较高和不易反复使用等缺点［1］ 。近年来随着分子生物学的快速发展，各国学者把基因治疗应用于骨缺损的治疗，给人们提供了新的思路，现对其研究进展作一综述。

    1   基因治疗的策略

    基因治疗是上世纪后期以来在重组DNA技术的基础上迅速发展起来的一项应用技术，是将遗传物质导入载体或受体细胞，通过替代缺陷基因，修正错误基因，对抗异常基因，调节基因产物的表达等方式，以实现治疗疾病目的的一种治疗方法。基因治疗有4个关键步骤:转导、复制、翻译、及表达，主要采取两条治疗策略，即体内途径和体外途径。体内途径（in vivo）又称直接基因治疗，是将目的基因直接导入体内，并使目的基因表达，以补充某些生物活性物质的表达的方法;体外途径（ex vivo）的基因治疗又称间接基因治疗，它是将靶细胞在体外先进行基因修饰，使表达某些具有治疗作用的生物活性物质，然后再将基因修饰过的细胞移植到体内［2］ 。

    2   基因治疗在骨缺损治疗中的应用

    2.1   目的基因的研究 目前对目的基因研究最多的是BMPs家族，Lindsey等［3］ 用分别带有骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和β-半乳糖苷酶基因的5-腺病毒载体来治疗成年无胸腺裸鼠的鼻部骨缺损，术后120天处死动物，检查发现BMP-2组有较多的新骨形成，且新骨的强度更好。Wang等［4］ 用腺病毒通过体外途径将rhBMP-2基因转染到鼠的骨髓细胞，分别复合胍酸盐萃取的脱矿骨基质和明胶海绵，用于鼠的脊柱融合，对照组分别用rhBMP-2分子复合上述基质材料、自身髂骨、单纯基质材料等，术后4周实验组均发生融合，且生成较粗的小梁骨，而对照组在8周内还未见融合，有少量薄带状小梁骨，结果表明该基因修饰的骨髓细胞能产生足够BMP-2分子，从而诱导脊柱融合。Peng等［5］ 研究表达人BMP-4和VEGF（血管内皮生长因子）基因工程化的肌源性细胞，用体外途径修复骨缺损，结果表明VEGF能增加BMP-4募集间充质细胞并增强该细胞活性的作用，促进骨的形成及骨缺损的修复。Deckers等［6］ 研究表明，在骨形成和骨折愈合过程中，VEGF和BMP-2的表达是1对偶联过程，二者相互促进，起到级联放大效应。BMP-2可以使成骨样细胞VEGF高表达而刺激骨块的血管生成，并且VEGF的产生与微环境中BMP-2的浓度呈正相关，这种影响是BMP特异的，VEGF也可促进成骨细胞的分化。Shen等［7］ 把胰岛素样生长因子-1（IGF-1）基因转染到纯株多能间充质干细胞系，并转入半乳糖苷酶（D1-BAG）作为组织学标记，将该细胞系统性注入鼠股骨骨折部位，髓内固定，结果表明在该位点能检测出大量标记基因和更多的矿化骨痂，促进骨折的愈合。刘勇等［8］ 将TGF-β1基因导入成骨细胞，通过原位杂交检测和成骨细胞培养上清液TGF-β1活性测定，了解转染细胞TGF-β1的表达，检测基因转染及转染细胞上清对成骨细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响，观察TGF-βl基因转染成骨细胞生物学活性的变化，结果表明TGF-βl基因转染鼠成骨细胞可显著促进该基因表达，转染细胞生物学特性保持稳定。Edwards等［9］ 从胎肺组织分离出人声波猬基因（human sonic hedgehog，Shh）并将其克隆入复制缺陷的逆转录病毒载体，再转入纤维母细胞、间充质细胞、脂源性细胞，用该细胞复合藻酸盐.1-型胶原修复兔颅骨缺损，鼠的β-肌动蛋白启动子复合体驱动Shh的表达，反转录聚合酶联免疫反应分析证明shh-RNA的表达，用酶链免疫吸附试验（ELISA）证明有shh-蛋白质的分泌，植入后6～12周通过大体观察、X线、组织学分析，有新的全厚骨形成，修复该缺损并具有统计学意义。

    2.2   载体的研究 腺病毒和腺相关病毒是应用较多的基因转导载体，Ito等［10］ 认为腺病毒载体是基因治疗的重要工具，它通过结合细胞膜上的柯萨奇腺病毒受体（CAR）入侵细胞，该受体在正常成年动物表达较低，他们制作鼠肋骨骨折模型，术后在该处骨痂中的成纤维样细胞发现CAR的表达，并有Ⅰ型胶原和骨桥素的mRNA表达，该细胞定义为不成熟的成骨细胞，即为腺病毒介导基因转导的靶细胞。Chang等［11］ 用复制缺陷腺病毒通过体外途径将BMP-2基因转入扩增的骨髓间充质干细胞，再用该细胞复合生物可吸收内夹板来修复猪的上颌骨缺损，3个月后该处填充为矿化良好的编织骨，且生物力学测试表明该骨与正常上颌骨无明显差异，该方法能有效地修复骨缺损。Chang等［12］ 用复制缺陷腺病毒体外途径将hBMP-2基因转入已经体外培养1个月猪的骨髓间充质细胞，再复合Ⅰ型胶原植入猪的颅骨缺损部位，对照组则用转染β-半乳糖基因的骨髓间充质细胞修复，术后6周～3个月观察，结果表明实验组新骨形成的区域较大，生物力学测试新骨的抗压强度与正常的颅骨相同。Chen等［13］ 认为BMP的基因治疗因腺病毒的免疫原性常用免疫缺陷动物或者用体外转导方法，操作较困难，而腺相关病毒（AAV）与免疫原性和人类疾病无关。他们用AAV把BMP-2基因体内转入具有免疫活性的Sprague-Dawley鼠的成肌细胞，该基因修饰细胞能表达BMP-2蛋白并诱导成骨活性，有大量的新骨形成。粟向东等［14］ 将hBMP-2的cDNA连入真核表达载体pcD-NA3，形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP-2，在脂质体介导下，导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3），继续培养4周，然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测hBMP-2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果证实转染pcDNA3-hBMP-2后的成纤维细胞内有大量hBMP-2的mRNA转录和蛋白的表达。李建军等［15］ 通过体外途径构建人骨形成蛋白-2（hBMP-2）真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2，转染人骨髓基质干细胞，体外扩增培养4周后，用免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测该细胞在mRNA水平和蛋白质水平，均有BMP-2的表达，通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析见细胞上调VEGF表达，pcDNA3.1-hBMP-2转染基质干细胞群（MSCs）能促进该细胞增殖，并通过VEGF的表达增加促进血管再生，为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠 定了实验基础。Park等［16］ 对照研究脂质体和腺病毒作为BMP-2的基因载体，将目的基因通过体外途径转染到骨髓间充质细胞，修复鼠的颚骨缺损，术后用分子原位杂交、X射线和免疫组化等分析新生组织，两组均明显表达BMP-2，且检测出骨基质的标记物如骨桥蛋白和骨钙蛋白，后组骨缺损的愈合时间较前者短，但都完全愈合。而脂质体作为BMP-2的基因载体制作简便、不限制DNA大小及较少的免疫和安全性问题，有望成为该基因转导的最佳载体。Huang等 ［17］ 用非病毒载体聚氮丙啶（poly ethylenimine，PEI）浓缩编码BMP-4的质粒DNA复合聚乳羟基乙酸支架，使该质粒DNA能在局部持续性释放，修复颅骨的临界缺损，对照组用非浓缩的质粒DNA、空白支架材料，术后通过组织学和X线分析发现，实验组的成骨量是对照组的4.5倍，较好地修复该骨缺损。

2.3   靶细胞的研究 Musgrave等

    ［18］ 把BMP-2基因用腺病毒通过体外途径转入5种不同的细胞:骨髓间充质细胞系、主要肌源性细胞、骨髓间充质细胞、关节软骨细胞、成纤维细胞。所有的细胞均能表达BMP-2蛋白，从而具有成骨活性，但修饰后的骨髓间充质细胞系和肌源性细胞比其它细胞能分泌更多的蛋白，成骨活性也更高。通过体内途径将该基因修饰的几种细胞注入体内也能分泌BMP-2蛋白，具有成骨活性。Goldstein等［19］ 证明在鼠、狗及羊动物模型中将带有甲状旁腺激素或骨形成蛋白的质粒DNA通过三维结构基质体内植入到骨缺损部位，创伤修复的纤维母细胞移行至基质，相遇并吞入质粒DNA，能产生该质粒编码的蛋白，促进骨的形成及大段骨缺损的修复。Cui等［20］ 用转入有半乳醛糖苷-Z（LacZ）及耐新霉素基因的纯株的骨源性细胞，对照混合的骨髓间充质细胞用于无胸腺裸鼠的后路脊柱融合，6周后检查发现前组融合率100%，且融合得更快，后组融合率只有50%，对照组则没发生融合。Lee等［21，22］ 用腺病毒将rh-BMP-2基因转导至正常雄鼠的肌源性细胞，再将该细胞复合明胶海绵修复重症联合免疫缺陷大鼠的颅骨缺损，术后用免疫组化和原位特殊染色体杂交等技术分析，结果表明该细胞能高效表达BMP-2蛋白，能向成骨细胞分化治愈骨缺损。Krebsbacb等［23］ 应用鼠BMP-7构建了腺病毒Ad-CMVBMP-7真核表达载体，转染人牙龈成纤维细胞和鼠皮肤成纤维细胞，移植到免疫抑制鼠，这些非骨组织形成了骨，免疫组化和原位杂交证实该新生骨为人源和鼠源的混合物，这些转染的非骨性细胞不仅在体内外分泌了有活性的BMP-7，而且在体内分化成成骨细胞，这个模型说明可采用如牙龈、皮肤等容易取得并能再生的组织进行骨的基因治疗。徐小良等［24］ 通过体外途径用腺病毒将hBMP-2基因转染到兔骨髓间充质干细胞（BM-SCs），然后用该细胞复合天然滨珊瑚，修复兔的桡骨缺损，术后能检测出转染细胞表达并分泌BMP-2分子，5周后缺损区可见多量骨痂形成，12周时缺损完全愈合，骨皮质形成骨髓腔再通，Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs是修复骨缺损的好方法。

    3   前景及展望

    基因治疗在骨科领域的应用，正在迅速地从实验室走向临床，可望为骨科临床治疗提供全新的治疗方法。但目前还存在一些难解决的问题，比如安全性、费用、伦理道德等，基因治疗的条件和方法还有待优化。但我们相信，随着人类基因组计划和后基因组计划的顺利实施，以及上述问题的迅速解决，将基因治疗与组织工程学有机结合运用于骨缺损的研究和治疗，具有广阔的临床应用前景。

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     （重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016）