豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的分离、培养及其鉴定

　　作者：王乾    作者单位：新疆石河子大学医学院一附院泌尿外科，新疆石河子 832008

　　【摘要】  目的 探索豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的原代培养方法。方法 颈部脱臼法处死豚鼠，无菌条件下分离出膀胱肌组织制备成肌条，采用Ⅴ型胶原酶酶解法分离细胞，将细胞悬液接种于含干细胞因子的细胞培养基中培养，隔日换液。用酪氨酸蛋白激酶受体特异性抗体标记细胞，证实细胞类型。结果 培养后的Cajal样间质细胞保持其固有特征，可见胞体为梭形且胞体两极有两个细长突起，该类细胞酪氨酸蛋白激酶受体抗体荧光染色阳性证实细胞培养成功。结论 用Ⅴ型胶原酶消化法可获得成年豚鼠膀胱Cajal样间质细胞，并在体外条件下生长，可用于Cajal样间质细胞的电生理学研究。

　　【关键词】  干细胞因子 Ⅴ型胶原酶 酪氨酸蛋白激酶受体 Cajal样间质细胞

　　1893年，西班牙神经解剖学家Cajal用甲基蓝及嗜银染色法在胃肠道神经系统中观察到一类特殊的间质细胞，命名为Cajal间质细胞(interstitial cell of cajal, ICC)。1996年，Smut和Jonavicius等[1]首先描述了在豚鼠和人逼尿肌上与Cajal类似的膀胱间质细胞。最新的研究表明，泌尿系Cajal样细胞是一种特殊间质细胞，它可能是泌尿系平滑肌蠕动的起搏者，在神经肌肉信号传递中起调节作用[2]。其结构功能异常可能为某些膀胱动力障碍性疾病的发生机制，因而Cajal样间质细胞功能学研究成为国际尿动力学研究的热点。体外培养细胞，由于影响因素单一，是研究细胞功能以及相应细胞信号转导机制的基础[3]。为此，我们以豚鼠膀胱为Cajal样间质细胞的组织来源，应用酶解法并结合密度离心技术[4]，建立了Cajal样间质细胞的分离、培养方法。酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性结合细胞具有的特殊形态是目前公认的鉴定Cajal间质细胞的方法[6]。我们应用免疫荧光染色对分离的Cajal样间质细胞进行了鉴定，结果提示该培养方法是稳定可靠的。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料  实验动物：1-2月龄成年豚鼠2只，雌雄不限，由新疆石河子大学实验动物中心提供。试剂：DMEM培养基(Sigma公司)，SCF(Sigma公司)，Ⅴ型胶原酶(Sigma公司)，Antibiantibiotic(Sigma公司)，FBS(Hycone公司)，大鼠抗小鼠酪氨酸蛋白激酶受体抗体(bioscience公司)，兔抗大鼠FITC标记荧光抗体(Sigma公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  膀胱组织单细胞悬液的制备  颈部脱臼法处死豚鼠，下腹部碘伏消毒后正中切口，于膀胱颈处离断取出膀胱。于解剖显微镜下仔细剔除膀胱外膜，纵行剖开膀胱、去除膀胱黏膜，将膀胱肌层置入含双抗(青霉素100u/L和链霉素100mg/L)的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min。将上述处理的肌层组织剪成1mm3小块，在含双抗的磷酸盐缓冲溶液中漂洗2次；换入10g/L胶原酶溶液Ⅴ，置入37℃培养箱中消化30min，完全消化溶解后，移入离心管中离心。

　　1.2.2  细胞培养  细胞沉淀中加入新鲜配制的DMEM培养基溶液(含体积分数为0.2的胎牛血清)，吹打后按每瓶(容积25mL)含(25-30)×104活细胞接种在培养瓶内，37℃、5% CO2孵箱内静置培养。细胞接种第2天，可见胞体为梭形并有两个突起的细胞贴壁，平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶，孵箱内静置3d后，可见平滑肌细胞贴壁。

　　1.2.3  培养细胞的观察与鉴定  在倒置显微镜下观察培养细胞的形态、贴壁情况、生长速度和密度。免疫荧光染色鉴定：将无菌盖玻片置6孔板底，加入约1×105细胞和2mL培养基，5% CO2孵箱培养；第2天将未贴壁细胞转移至另6孔板中。3d后细胞贴壁，取出盖玻片，丙酮固定10min；0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液充分漂洗，10g/L胎牛血清白蛋白孵育30min后加入酪氨酸蛋白激酶受体单克隆抗体，4℃ 48h；兔抗大鼠FITC标记荧光抗体，25℃ 60min；750mL/L甘油封固，荧光显微镜下观察。各步骤间用磷酸盐缓冲溶液漂洗3次，每次5min。

　　2  结果    　　细胞接种于培养瓶第2天，倒置显微镜下可见胞体为梭形，在细胞两极有两个突起的细胞贴壁(图1)。培养的细胞酪氨酸蛋白激酶受体免疫荧光染色为阳性(图2)。根据其形态和免疫学特性，证实该类细胞为Cajal样间质细胞。逼尿肌细胞贴壁能力稍差，接种后第2天未能贴壁。将其转移至另一培养瓶，绝对静置3d后贴壁，倒置显微镜下细胞呈梭形，突起不明显，相同放大倍数下逼尿肌细胞明显大于Cajal样间质细胞。

　　3  讨论    　　根据Cajal样间质细胞在胃肠道兴奋起源、动力产生和功能调控方面的重要作用以及逼尿肌和胃肠道平滑肌相似的生理特性，我们推测Cajal样间质细胞可能是泌尿系平滑肌蠕动的起搏者，在神经肌肉信号传递中起调节作用。电生理特性研究是了解细胞尤其是起博细胞功能的重要手段。体外培养细胞，由于影响因素单一，是研究细胞功能以及相应细胞信号转导机制的基础。但由于Cajal样间质细胞与许多类型的细胞之间紧密相连，如平滑肌细胞和神经纤维束，同时成年豚鼠膀胱Cajal样间质细胞包埋在致密结缔组织基质中[5]，尤其是胶原纤维存在，使Cajal样间质细胞体外培养方法一直不成熟，制约着Cajal样间质细胞的基础研究。有关豚鼠膀胱Cajal样间质细胞培养的相关报道较少。我们参考相关文献，首次采用Ⅴ型胶原酶进行消化、培养，因为胶原酶Ⅴ具有很好的活性、消化时间短、价格便宜，且对细胞损伤较小。经过大量的实验后，我们成功建立起了一套Cajal样间质细胞培养、鉴定方法。结果显示该类细胞在培养的第2天即贴壁，而逼尿肌细胞贴壁能力较差，需静置3d后才能贴壁。利用两者贴壁能力的差异，第2天移走未贴壁的逼尿肌细胞可得到相对纯化的Cajal样间质细胞。这为应用膜片钳研究其电生理特性奠定了基础。

　　图1  细胞接种于培养瓶第2天，倒置显微镜下可见胞体为梭形，在细胞两极有两个突起的细胞贴壁（略）

　　图2  酪氨酸蛋白激酶受体免疫细胞化学染色阳性（略）    　　酪氨酸蛋白激酶受体位于细胞膜，也是干细胞生长因子受体，可表达于造血细胞、肥大细胞及Cajal样间质细胞等多种细胞[6]。由于平滑肌细胞、神经纤维和成纤维细胞不表达酪氨酸蛋白激酶受体，酪氨酸蛋白激酶受体免疫荧光染色是鉴别胃肠道和膀胱Cajal样间质细胞的可靠方法。本实验体外培养的细胞经免疫荧光染色后，Cajal样间质细胞表面酪氨酸蛋白激酶受体呈阳性，胞体和突起均明显着色，表明Cajal样间质细胞在体外培养成功。    　　我们认为在Cajal样间质细胞培养的过程中需要注意以下几个问题：①避免污染；②尽可能缩短在缓冲液以及胶原酶消化溶液中的时间；③换液并冲洗去除未贴壁细胞，为Cajal样间质细胞生长创造良好条件；④培养基中加入干细胞因子是维持Cajal样间质细胞表型的关键因素。

【参考文献】      [1]Smut PJ, Jonavicius J, Marshall VR, et al. Distribution of nitric oxide synthaseimmunoreactive nerves and identification of the cellular targets of nitric oxide in guineapig and human urinary bladder by cGMP immunohistochemistry [J]. Neuroscience, 1996, 71:337348.

　　[2]Hashitani H. Interaction between interstitial cells and smooth muscles in the lower urinary tract and penis [J]. J Physiol, 2006,576(Pt 3):707714.

　　[3]McHale NG, Hollywood MA, Sergeant GP, et al. Organization and function of ICC in the urinary tract [J]. J Physiol, 2006, 576(Pt 3):689694.

　　[4]Lang RJ, Tonta MA, Zoltkowski BZ, et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajallike cells as pacemakers [J]. J Physiol, 2006, 576(Pt 3):695705.

　　[5]Davidson RA, McCloskey KD.Morphology and localization interstitial cells in the guinea pig bladder: structural relationships with smooth muscle and neurons [J]. J Urol, 2005, 173(4):13851390.

　　[6]Vannucchi MG. Receptors in interstitial cells of Cajal： identification and possible physiological roles [J]. Microsc Res Tech, 1999, 47(5):325335.