siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用

作者                单位

杨萍　　   江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江

严金川　　 江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江

刘培晶　　 江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)进入细胞后，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对，进而引发靶mRNA的降解、抑制靶基因的表达。RNAi因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用正越来越多地被应用于多种疾病的预防和治疗研究[1]。siRNA必须进入细胞内才能发挥对基因的沉默作用[2]，因此，如何将外源性siRNA高效地转入靶细胞就成为基因抑制成功与否的关键。

基因转染的方法很多,如磷酸钙沉淀法、电穿孔、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒法等。

逆转录病毒是目前效率最高的转染载体，但由于其价格昂贵，构建耗时而不作为实验的首选。阳离子脂质体法是较方便的转染方法之一[ 3]，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中,多以阳离子脂质体进行转染，但其对于原代悬浮细胞仍存在转染效率低的问题，故本实验在脂质体的介导下，运用反向转染法[4]和传统正向转染法转染小鼠脾淋巴细胞，比较两种方法的转染效率，寻找对原代悬浮细胞更高效的基因转染方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

8～10周清洁级 BALB/c 雌性小鼠(扬州大学比较学院实验动物中心)，小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)，RPMI1640培养基，OptiMEM无血清液体培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)，Cy3荧光标记的siRNA片段(广州锐博生物科技有限公司)，24孔板(Corning公司)， 荧光倒置显微镜(Olympus公司)，流式细胞仪(BD公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠脾淋巴细胞收集

断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡2～3 min,无菌超净台内取出脾脏，将200目无菌不锈钢筛网置于60 mm平皿中，加入适量Hank′s液，脾脏剪成碎块置筛网内，无菌玻璃注射器活塞轻柔研磨，使得分散的单细胞透过筛网进入Hank′s中;Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，用PBS将所得细胞沉淀洗涤两遍，重悬于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，计数及台盼蓝染色计算活细胞数。

1.2.2 细胞转染

实验共分为3组。实验组采用反向转染法，①每孔加Cy3siRNA 1.5 μl至不含血清的OptiMEM简化培养基200 μl中稀释;②用前摇匀RNAiMAX, 取3 μl至每孔中，与①液轻柔混匀成为转染复合物，室温孵育20 ～30 min;③用不含抗生素的RPMI1640完全培养基稀释细胞，每孔细胞悬液为400 μl，整细胞数为(1～1.5)×106，加入②液中，轻微前后推动平板使其混匀，每组设复孔。对照组按照传统的正向转染法操作，先将细胞在孔板中孵育24 h后再加入转染复合物，所加物质用量及浓度与实验组完全相同。空白组未转染siRNA细胞。将3组细胞均置于5 % CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养，于4～6 h后更换含10%小牛血清的完全培养基。

1.2.3 细胞活性测定

转染后24 h每组细胞各取1×106，分别用0.4 %的台盼蓝染色5 min后,随机各选取3个视野,显微镜下计数所有细胞。以下列公式计算细胞存活率：细胞活性=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%。实验平行重复3次。

1.2.4 细胞生存状态观察

转染后24 h倒置显微镜下(10×20)每组随机取3个视野观察各组细胞，从细胞形态、细胞膜完整性、细胞数目等方面评估生存状态。

1.2.5 荧光倒置显微镜观察转染效果

转染后24 h，荧光倒置显微镜观察各组Cy3siRNA转染细胞的荧光携带率。Cy3为红色荧光标记物，应用Cy3siRNA转染小鼠淋巴细胞后，根据细胞内红色荧光的数量来判断转染阳性细胞的数量[5]。于可见光下固定一个视野, 计数细胞总数, 转换荧光光源计数携带红色荧光的细胞数,转染效率=有荧光表达的细胞数/细胞总数×100%, 每组选取3孔细胞，每孔细胞随机选择5个观察视野，重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测转染效率

转染后24 h实验组和对照组各取 1×106细胞，4℃ PBS洗细胞2次。流式细胞仪计数发红色光的细胞数，计算转染效率。

1.2.7 统计学处理 采用配对t检验比较两种转染方法转染效率的差异，SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性测定

细胞转染后24 h台盼蓝拒染率计算结果显示：实验组细胞活性为89.5%，对照组和空白组分别为84.5%和94.9%，3组之间细胞活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 细胞生存状态观察

倒置显微镜下观察比较转染后24 h实验组、对照组和空白组之间细胞生存状态，结果显示3组无明显差异。

2.3 荧光显微镜下细胞荧光表达率

实验组和对照组细胞内均可见红色荧光，实验组带有红色荧光的细胞数量明显多于对照组，空白组无荧光信号;实验组与对照组经重复实验得到平均转染率分别为69.58%和39.83%，表明实验组较对照组转染效率高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表1。表1 实验组和对照组的转染效率(略)

2.4 流式细胞术检测转染效率

转染后24 h，实验组和对照组的Cy3siRNA对小鼠淋巴细胞的转染效率分别为63%和29%，实验组转染效率明显高于对照组(P<0.05)。见图3。

3 讨论

高效的siRNA转染是研究基因沉默是否成功的前提。目前，RNAi由于转染效率低而成为其发展的瓶颈并限制其进一步应用[6]。所以选择最合适的转染方法是整个实验非常重要的一步。siRNA转染的方法很多，磷酸钙沉淀法虽然操作简便，但转染效率低，重复性差;电穿孔法适用于所有细胞，电压越高，转染效率越高，而细胞的存活率越低，成功的电穿孔均伴随高水平的细胞毒性,因此其应用受到了限制;DEAE葡聚糖多用于DNA分子的转染，仅限于瞬时转染，且一般只用于BSC1,CV1,COS细胞系;显微注射法是用微吸管吸取siRNA溶液,在显微镜下准确的插入细胞核中,将siRNA注射进去，转染率高,对细胞无药物毒害,但是技术要求高，操作繁琐耗时,工作效率低,装置昂贵;阳离子脂质体在克服细胞屏障方面与病毒相似，容易透过细胞膜，而且操作简便，容易实施，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中得到了广泛的应用，但对于原代细胞、悬浮细胞仍存在转染效率低的情况[7];逆转录病毒法适用于各种细胞，转染效率高，但构建病毒载体耗时长且价格昂贵，尤其不适合于有效片段的筛选实验[8]，并且需考虑安全因素。以上方法均有其优缺点，通过对各种转染方法的综合考虑，本实验选用脂质体为媒介转染小鼠脾淋巴细胞，基于其在采用传统正向转染法时对原代悬浮细胞存在转染效率较低的现象，我们应用反向转染法克服这一困难，把提高转染效率作为实现高效沉默靶基因的基础。

转染效率除了由转染方法所决定外，转染细胞状态和siRNA剂量、转染试剂的选择、转染复合物的孵育时间、培养液中血清和抗生素含量等也是影响转染效率的重要因素。本实验在以上条件参数恒定和规范操作的基础上，提取小鼠脾淋巴细胞，选用脂质体Lipofectamine RNAiMAX介导转染小鼠淋巴细胞，RNAiMAX比Lipofectamine2000细胞毒性小，转染悬浮细胞效果更好;并用荧光素Cy3标记siRNA，使转染情况在镜下直接可见,从而提高实验的准确性。反向转染法与传统正向转染法的区别[9 ]是传统方法需在转染前一天接种细胞铺板，培养24 h后再加转染复合物转染;而反向转染则是先加入转染试剂和siRNA混合物在培养板上共同温育数十分钟，然后加入细胞铺板培养，其优点在于：①节约培养时间，淋巴细胞体外存活时间有限，可为转染后检测提供充足的时间和保持细胞良好的生存状态;②操作程序简便，避免传统正向转染方法培养条件的频繁变化对细胞表达可能产生的影响;③转染效率高，对于原代悬浮细胞可实现高效转染，从而使干扰效果比传统方法更好。1小时即可完成转染，快速、省时并且操作方便。实验在转染后24 h台盼蓝染色检测各组细胞活性、显微镜下观察各组细胞生存状态;从荧光显微镜及流式细胞仪两方面检测转染效率。

在其他实验条件相同的情况下，实验组与对照组的转染效率分别为66.5%和34.5%，说明反向转染得到的RNA转染效果比传统转染方法更好，对于原代细胞、悬浮细胞这一类难以转染的细胞也能得到较为理想的转染效果，值得一试。同时，转染24 h后实验组、对照组及空白组台盼蓝染色细胞活性分别为89.5%，84.5%和94.9%，显微镜下细胞生存状态亦无明显差异，提示该方法细胞毒性较低，操作过程对细胞损伤较小，对于原代悬浮细胞有着很好的应用前景，为siRNA转染原代悬浮细胞及应用RANi技术进行体外研究提供了实验依据。

【参考文献】

[1]Bi F，Liu N，Fan D. Small interfering RNA：a new tool for gene therapy[J]. Curr Gene Ther, 2003,3(5)：411-417.

[2]Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001,411(6836)：494-498.

[3]Echeverri CJ，Perrimon N. Highthroughput RNAi screening in cultured cells：a user′s guide[J].Nat Rev Genet，2006，7(5)：373-384.

[4]LaPan P, Zhang J, Pan J. et al. Quantitative optimization of reverse transfection conditions for 384well siRNA library screening[J ]. Assay Drug Dev Technol，2008，6(5)：683-691.

[5]Erfle H, Simpson JC, Bastiaens PI, et al. siRNA cell arrays for highcontent screening microscopy[J]. Biotechniques，2004，37(3)：454-458.

[6]Erfle H, Neumann B, Liebel U, et al. Reverse transfection on cell arrays for high content screening microscopy [J].Nat Protoc，2007，2(2)：392-399.

[7]宋尔卫. RNA干扰的生物学原理与应用[M].北京：高等教育出版社,2005.

[8]Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus mediated RNA interference[J].Cancer Cell，2002,2(3)：243-247.

[9]Fujita S, Ota E, Sasakia C, et al. Highly efficient reverse transfection with siRNA in multiple wells of microtiter plates[J]. J Biosci Bioeng，2007,104(4):329-333.