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    《胸外科学》

    胆管癌细胞层黏连素受体过表达上调Fas配体的研究

    发表时间：2012-07-26  浏览次数：949次

    　　作者：高占峰,李天宇,高应鸿,蒋卫伟,吴虹晔　　作者单位：重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院

    　　【摘要】 目的 探讨胆管癌细胞层黏连素受体(laminin receptor,LNR)过表达与Fas配体(Fas ligand,FasL)作用的关系。方法 采用脂质体转染法转染顺义、反义LNR寡核苷酸至胆管癌细胞QBC939中，用RTPCR和细胞免疫组织化学方法检测两组细胞FasL及LNR的表达情况。结果 转染反义组LNR和FasL基因表达均较转染顺义组明显降低(t=14.136,25.161,P0.01)。结论 LNR过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用可能是通过FasFasL信号通路实现的。

    　　【关键词】 胆管肿瘤; 层黏连素受体; Fas配体

    　　Overexpression of laminin receptor in upregulating Fas ligand in cells of cholangiocarcinoma GAO Zhanfeng, LI Tianyu, GAO Yinghong, JIANG Weiwei, WU Hongye, WANG Shuguang. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    　　Corresponding author WANG Shuguang, Email sgwang90@yahoo.com.cn

    　　【Abstract】 Objective To explore the relationship between overexpression of laminin receptor(LNR) and Fas ligand (FasL) in cells of cholangiocarcinoma. Methods Sense and antisense oligonucleotides of LNR were transfected into the cholangiocarcinoma cell line QBC939 by the method of liposome transfection. The expressions of FasL and LNR were detected by RTPCR and immunohistochemistry. Results Compared with sense oligonucleotide of LNR, the expression of LNR and FasL in antisense oligonucleotide of LNR was significantly downregulated (t=14.136, 25.161, P0.01).Conclusions The effect of overexpression of LNR on immune evasion of cholangiocarcinoma is realized via the FasFasL pathway.

    　　【Key words】 Cholangiocarcinoma; Laminin receptor; Fas ligand

    　　层黏连素(laminin，LN)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 的主要成分。肿瘤细胞膜上含有其配体即层黏连素受体(laminin receptor，LNR)，两者结合可诱导分泌包括IV型胶原酶在内的蛋白水解酶, 后者有助于肿瘤细胞的侵袭和转移。我们前期研究发现LNR过表达与临床胆管癌恶性表型关系密切[1-4]。本研究将探讨LNR在胆管癌免疫逃逸机制中与Fas配体(Fas ligand,FasL)作用的关系。

    　　1 材料与方法

    　　1.1 试剂

    　　RPMI 1640培养液、胰酶和胎牛血清均购自美国Hyclone公司;鼠抗人层黏连蛋白受体单克隆抗FastTM Transfection Reagent转染试剂盒和SV Total RNA Isolation System试剂盒购自美国Promega公司;逆转录试剂盒购自杭州博日科技公司;PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司。

    　　1.2 细胞培养

    　　人肝外胆管癌细胞株QBC939是一株来源于人肝门部胆管癌的右肝转移灶，为低分化腺癌，由本研究所王曙光建株保存[5]。在37 ℃，5% CO2条件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 Uml)、链霉素(100 mgL)的RPMI 1640培养液进行细胞培养和传代。

    　　1.3 设计合成LNR顺义、反义寡核苷酸

    　　按反义寡核苷酸的设计要求，针对LNR mRNA序列(Gene Bank：NM 002295)核心区的AUG上、下游序列，设计18聚同源和互补的寡核苷酸[6]。所设计的序列如下：LNR反义寡核苷酸序列(18mer)：5’GGCTCCGGACATTGTGAA3’;LNR顺义寡核苷酸序列(18mer)：5’TTCACAATGTCCGGAGCC3’。LNR顺义、反义寡核苷酸(全硫代修饰)+绿色荧光标记由上海生物工程技术服务有限公司合成。

    　　1.4 顺义组、反义组LNR细胞转染

    　　取对数生长期QBC939细胞5×105个ml，采用脂质体转染法，具体操作方法同参考文献[7]。转染剂量为LNR顺义组、反义组寡核苷酸各3 μg，按DNA∶脂质体=1∶2进行转染。转染后48 h行细胞免疫组织化学和提取细胞总RNA进行RTPCR，检测LNR和FasL蛋白的mRNA表达。

    　　1.5 图像处理和统计学分析

    　　采用Quantity one凝胶定量分析软件对RTPCR凝胶条带进行分析，用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析。

    　　2 结果

    　　2.1 顺义组、反义组LNR细胞转染

    　　顺义组和反义组细胞转染效率均达到95%以上(图1，2)。

    　　2.2 顺义组、反义组LNR细胞免疫组织化学

    　　LNR和FasL阳性反应物成棕黄色颗粒，主要位于细胞膜和胞质内。转染反义组LNR阳性表达较转染顺义组明显降低，说明通过转染反义的LNR寡核苷酸可以沉默LNR基因表达(图3，4)。同样，转染反义组FasL阳性表达较转染顺义组明显降低(图5，6)。

    　　2.3 顺义组、反义组LNR QBC939细胞RTPCR

    　　LNR和FasL mRNA RTPCR检测结果见图7。用Quantity one凝胶定量分析软件对RTPCR凝胶条带进行灰度扫描分析(图8)。转染反义组LNR和FasL基因表达均较转染顺义组明显降低(t=14.136,25.161,P0.01)。

    　　3 讨论

    　　在大多数情况下，肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视和攻击，进而在体内不受限制地生长和发生远处转移。其中，肿瘤细胞上调FasL的表达就是其中的机制之一。

    　　FasL是相对分子质量为40×103的Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子超家族成员，通过与细胞膜受体Fas结合激活Fas介导的死亡信号复合体，最终导致细胞凋亡。很多恶性肿瘤细胞包括结肠癌、胃癌、肺癌及脑胶质瘤等自身存在FasL过表达。高表达FasL可能通过诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)和NK细胞凋亡，抑制CTLs和NK细胞由Fas介导的杀伤肿瘤细胞作用，产生所谓肿瘤细胞的“反击”现象[8-9]。而且，在转移性肿瘤中，如在乳腺癌淋巴结转移灶及结肠癌肝转移灶中，FasL的表达明显高于原发灶肿瘤，并通过FasFasL途径诱导免疫细胞凋亡，从而抑制机体的全身免疫。这说明FasL的表达有利于肿瘤细胞形成新的转移灶。

    　　近年研究已证明，几乎所有恶性实体肿瘤细胞LNR，特别是相对分子质量为67×103的LNR表达上调，与肿瘤转移密切相关[10-11]。我们前期对LNR表达上调介导胆管癌转移的分子机制的研究发现：LNR过表达与临床胆管癌恶性表型关系密切，主要通过：(1)介导胆管癌细胞与ECM间黏附，激活局部黏附激酶而促进肿瘤的侵袭转移;(2)通过增强细胞骨架蛋白的表达和在胞质内的重排而增强癌细胞的运动能力;(3)介导蛋白水解酶MMP2、MMP9、uPA的mRNA和蛋白表达，提高肿瘤细胞对ECM的降解;(4)通过激活FAK激酶MAPK信号转导通路而调节胆管癌细胞侵袭过程。其次，我们还发现：当LNR反义寡核苷酸抑制高转移性胆管癌细胞的LNR过表达，则明显抑制胆管癌细胞的侵袭能力。李子禹等[12]已经在胆管癌细胞株QBC939中证明FasL高表达。

    　　上述研究提示LNR过表达与胆管癌细胞FasL表达上调可能存在内在联系。因此，本研究基于前期研究工作基础，通过转染反义LNR寡核苷酸沉默LNR基因的表达，研究LNR是否在胆管癌免疫逃逸中通过FasL来实现的。通过细胞免疫组织化学和RTPCR方法均提示在胆管癌中LNR过表达时FasL的表达异常增高，当将LNR基因沉默后，FasL基因的表达同时也降低。这说明LNR基因表达降低时可导致FasL基因表达相应降低。我们初步认为LNR过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用可能是通过FasFasL信号通路实现的。LNR过表达可能激活细胞内信号通路MAPK而调控FasL的基因转录，诱导CTLs凋亡，从而促进肿瘤转移。至于LNR过表达介导的肿瘤细胞金属蛋白酶是否促进细胞膜表面结合的FasL降解，形成可溶性FasL，干扰机体的免疫识别和攻击能力，以及LNR过表达具体与FasL启动子区域内哪些基因表达有关还有待于进一步研究。

    　　【参考文献】

    　　[1] 王曙光,陈长宏,李大江,等.胆管癌细胞层粘连素受体表达下调对蛋白水解酶uPA mRNA表达的影响.中华医学杂志,2004,84(19)1642-1644.

    　　[2] 刘子沛,朱瑾,王曙光,等.胆管癌组织中eIF4E和MMP9的表达及临床意义的研究.消化外科,2005,4(2)113-118.

    　　[3] 郑秀海,张丰深,马宽生,等.人胆管癌细胞神经周围浸润模型的构建与初步观察.消化外科,2005,4(5)354-356.

    　　[4] 郑秀海,张丰深,马宽生,等.胆管癌脱落细胞的形态学观察与生物学特性实验研究.消化外科,2005,4(2)132-134.

    　　[5] 王曙光,韩本立,陈意生,等.胆管癌浸润、转移及抗浸润实验研究.第三军医大学学报,1994,16(4)307.

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    　　[7] 陈健,李大江,王曙光.腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究.中华消化外科杂志,2007,6(4)294-298.

    　　[8] Whiteside TL. The role of death receptor ligands in shaping tumor microenvironment. Immunol Invest,2007,36(1)25-46.

    　　[9] Adachi K, Fujino M, Kitazawa Y, et al. Exogenous expression of FasLigand or CrmA prolongs the survival in rat liver transplantation. Transplant Proc,2006,38(8)2710-2713.

    　　[10]An SJ, Chen JK, Chen HJ, et al. Characterization of 67 kD laminin receptor, a protein whose gene is overexpressed on treatment of cells with antibenzo[a]pyrene7,8Diol9,10epoxide. Toxicol Sci,2006,90(2)326-330.

    　　[11]Von Knebel Doeberitz M. Is progression of HPVinfected cells within the cervical epithelium linked to modified interaction with the extracellular matrix The potential role of the 67kd nonintegrin laminin receptor 67LR. Acta Cytol,2006,50(1)1-2.

    　　[12]李子禹,张林,邹声泉.FasL在人肝门部胆管癌组织和胆管癌细胞中的表达及其对细胞凋亡的诱导作用.中华医学杂志,2002,82(9)606-609.