黑素瘤抗原3基因及蛋白在非小细胞肺癌中的表达

　　作者：燕振忠 作者单位：东营市人民医院心胸外科 东营市 257091

　　【摘要】 目的 检测黑素瘤抗原3(MAGE3)mRNA及其编码的肿瘤抗原在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达，探讨以该抗原作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法 用RTPCR方法和流式细胞术(FCM)对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE3 mRNA及蛋白的表达情况进行研究。结果 3种人肺癌细胞系均表达MAGE3 mRNA及蛋白;56例NSCLC标本中，30例表达MAGE3 mRNA，26例表达MAGE3蛋白，而相邻正常肺组织均不表达MAGE3 mRNA或蛋白。结论 MAGE3 mRNA及蛋白在NSCLC中具有较高的表达频率，提示该抗原有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。

　　【关键词】 肺肿瘤;非小细胞肺癌;黑素瘤抗原3;免疫治疗

　　Expression of MAGE3 gene and protein in nonsmall cell lung cancer

　　YAN Zhenzhong

　　People's Hospital of Dongying City，Dongying 257091

　　【Abstract】 Objective To determine the expression of melanoma antigen3 mRNA and its encoding tumor antigen in nonsmall cell lung cancer(NSCLC) and to explore the possibility of using this antigen as a vaccine for immunotherapy in NSCLC patients.Methods The expression of MAGE3 mRNA and protein in 3 human lung cancer cell lines and 56 NSCLC samples together with the adjacent normal lung samples was examined by RTPCR and flow cytometry(FCM).Results All 3 human lung cancer cell lines expressed MAGE3 mRNA and protein. Of the 56 NSCLC samples, 30 cases expressed MAGE3 mRNA and 26 cases expressed MAGE3 protein,but none of the adjacent normal lung samples expressed MAGE3 mRNA or protein.Conclusion MAGE3 mRNA and protein are expressed at a high frequency in NSCLC samples, and this antigen may possibly be the suitable target for immunotherapy in NSCLC patients.

　　【Key words】 lung neoplasms,nonsmall cell lung cancer,melanoma antigen3,immunotherapy

　　黑素瘤抗原3(MAGE3)基因是最初在恶性黑素瘤中发现的一种肿瘤抗原基因，其编码的抗原可以与人类白细胞抗原HLAA1结合，被自体细胞毒T淋巴细胞(CTL)识别，使CTL产生特异性杀伤肿瘤细胞的效应[1]。目前研究表明，MAGE3基因在多种恶性肿瘤中均有表达，而在正常组织中，除睾丸和胎盘外，均无表达[2]。因此，作为一种CTL介导的肿瘤特异性免疫治疗的适宜靶抗原，该基因在肿瘤免疫治疗的研究中日益受到重视。本研究旨在检测MAGE3 mRNA及蛋白在我国非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况，探讨以该抗原作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系与标本 以人髓性甲状腺癌细胞系TT作为阳性对照[1]，以小鼠成纤维细胞系3T3TK作为阴性对照。TT细胞、3T3TK和人肺癌细胞系SPCA1、A549、A431购自上海中科院细胞库，上述细胞系均贴壁生长于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液中。56例NSCLC和相邻正常肺组织标本取自我院胸心外科的手术病例，其中男32例，女24例，年龄30～77岁，平均65.4岁;术后病理证实为鳞状细胞癌29例，腺癌25例，大细胞癌2例。

　　1.2 总RNA抽提 培养细胞每(5～10)×106个加入1 ml Trizol裂解液; 将标本组织剪碎放入匀浆器中，每50 mg加入1 ml Trizol，彻底匀浆。将上述培养细胞和标本组织的裂解物移入1.5 ml Eppendorf管中，室温放置5 min，加入200 μl氯仿，振荡混匀，室温静置5 min;1.3×104 r/min，4 ℃离心15 min，将上层水相转移到干净的1.5 ml Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10 min;1.3×104 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，加入1 ml 75%乙醇，1.3×104 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，将沉淀置于室温干燥10 min，用DEPC处理水溶解，分光光度计定量。

　　1.3 逆转录合成cDNA第1链及PCR反应 按AMV逆转录酶(Promega公司)说明书配制逆转录反应体系，取2 μg总RNA，加入3 μl AMV逆转录酶，配成终体积为25 μl的反应体系，将该体系置于42℃孵育60 min，94 ℃ 5 min灭活酶，贮存于-20℃待扩增。MAGE3基因和内对照βactin的扩增引物由中科院生化所合成，序列分别为，MAGE3基因[3]：上游：5' TGG AGG ACC AGA GGC CCC C 3'，下游：5' GGA CGA TFA TCA GGA GGC CTG C 3'。βactin：上游：5ATC ATG TCG GAG ACC TAC AAC ACC CCA GCC3。下游：5AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA3。PCR反应体系的配制及反应条件详见参考文献[4]。每份标本均以βactin为内对照，除引物不同外其余条件相同。PCR反应在PE9600型扩增仪中进行，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分析。

　　1.4 流式细胞术(FCM)检测培养 细胞用0.02%EDTA消化后制为单细胞悬液;组织标本用MediMachine System细胞悬液制备仪制成单细胞悬液;将2种悬液的细胞密度用PBS稀释至1×106个/ml待测。用4%多聚甲醛固定5 min，0.5%Triton X100穿透15 min;加抗MAGE3抗原的单克隆抗体57B(瑞士Basal大学Spagnoli博士惠赠)，4℃过夜，每份样品设不加单抗的对照管;PBS清洗2次，加PE标记的山羊抗小鼠IgG，避光、冰浴30 min，PBS清洗2次。用流式细胞仪(EPICSXL型，Coulter公司)及其配套软件对样品进行检测和分析。

　　2 结果

　　2.1 MAGE3 mRNA在NSCLC中的表达 3种人肺癌细胞系均表达MAGE3 mRNA;56例NSCLC标本中，30例表达MAGE3 mRNA，阳性率53.6%，而相邻正常肺组织均不表达;MAGE3 mRNA的扩增产物为725 bp片段，βactin 扩增产物长度为422 bp。

　　2.2 流式细胞术检测结果 3种人肺癌细胞系均表达MAGE3蛋白。56例NSCLC标本中，26例表达MAGE3 蛋白，阳性率46.4%。相邻正常肺组织皆不表达该抗原。26 例MAGE3蛋白阳性的标本均表达MAGE3 mRNA，而有4例表达MAGE3 mRNA的标本未检测到MAGE3蛋白，与RTPCR检测结果的符合率为86.7%。

　　3 讨论

　　MAGE基因编码蛋白可在体内诱导特异性的CTL反应从而引发抗肿瘤免疫应答，其中以MAGE3基因的免疫原性较强，研究得较为清楚[5]。MAGE3编码的数种多肽可与不同的HLA分子结合，激活CTL的抗肿瘤反应，这些多肽已被尝试用作肿瘤疫苗以激发免疫保护反应。由此可见，MAGE3基因在目前肿瘤免疫治疗研究领域颇为引人关注，各国学者都在不断检测、鉴定MAGE3基因在各种肿瘤中的表达情况，以期对其进行以MAGE3基因为攻击靶点的免疫治疗。本研究结果显示，3种人肺癌细胞系均表达MAGE3 mRNA和蛋白，这对进一步进行多肽诱导CTL杀灭肿瘤细胞的研究提供了有利条件。56例NSCLC标本中。MAGE3 mRNA的表达率为53.6%(30/56)，表明以MAGE3基因编码抗原作为NSCLC免疫治疗的攻击靶点能够覆盖超过半数的病例，并有较好的特异性，是对NSCLC进行免疫治疗的理想攻击靶点。MAGE3蛋白的表达率为46.4%(26/56)，有4例表达MAGE3 mRNA的标本未检测到MAGE3蛋白，我们考虑可能是由于抗原表达量较少或是由于细胞悬液制备过程中有抗原的丢失，这说明，与RTPCR 扩增MAGE1 mRNA相比，FCM检测MAGE1抗原的方法敏感性稍差，但因FCM的操作简便，条件容易控制，所以仍不失为一种筛选免疫治疗对象的可行性方法。实验中所检测的56例正常肺组织均不表达MAGE3 mRNA或蛋白，这一结果提示，除了作为肿瘤免疫治疗的攻击靶点，MAGE3基因还有望在NSCLC的早期诊断、微转移灶检测以及复发的监测等工作中发挥作用。

　　【参考文献】

　　[1] Zendman AJ, Ruiter DJ, van Muijen GN. Cancer/testis associated genes: Identification, expression profile, and putative function[J].J Cell Physiol, 2003，194(3):272288.

　　[2] Gillespie AM，Coleman RE.The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy[J].Cancer Treat Rev，1999，25(4)：219217.

　　[3] Rimoldi D, Salvi S, Reed D,et al.cDNA and protein characterization of human MAGEA10 [J].Int J Cancer, 1999，82(6):901907.

　　[4] Van Pel A, De Plaen E, Duffour MT,et al.Induction of cytolytic T lymphocytes by immunization of mice with an adenovirus containing a mouse homolog of the human MAGEA genes[J].Cancer Immunol Immunother, 2001，49(11):593602.

　　[5] Brossart P. Dendritic cells in vaccination therapies of malignant diseases[J].Transfus Apheresis Sci, 2002，27(2):183186.

　　[6] Marchand M, van Baren N, Weynants P,et al.Tumor regression observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE3 and presented by HLAA1[J].Int J Cancer,1999,80(2):219230.