温缺血1 h对猪离体肺动脉平滑肌功能的影响

　　作者：何占锋 赵松 王作培 李晓辉 张锋 丁凯 韦海涛 施巩宁 作者单位：河南大学淮河医院胸心外科，河南 开封 475000

　　【摘要】 目的 探讨温缺血1 h对“无心跳供体”肺动脉平滑肌功能的影响，为 “无心跳供体”肺的临床应用提供科学依据。方法 瑞典家猪16头，随机分为有心跳供体(heartbeating donor,HBD)组和无心跳供体(nonheartbeating donor,NHBD)组，分别获取内径约1.5 mm的肺动脉段，截至1.5 mm长的无分支的肺动脉环，用TissueOrganBath装置和高钾Krebs溶液、血栓烷A2(TXA2)类似物U46619和罂粟碱测定血管平滑肌的收缩和舒张功能。结果 NHBD组与HBD组相比，由高钾Krebs溶液诱导的收缩值(mN)差异(25.81±1.86，26.80±1.59)无统计学意义(P>0.05)，U46619诱导的收缩值(mN)差异(18.63±2.24，20.23±2.09)无统计学意义(P>0.05)，而且均能完全舒张。结论 温缺血1 h的NHBD肺动脉平滑肌舒缩功能保存完好。

　　【关键词】 猪;肺动脉;无心跳供体;肺移植;U46619

　　1983年多伦多肺移植组首次报道了肺移植长期存活的成功经验〔1〕。随后许多国家的肺移植数量不断增加〔2〕。但是，由于供体的严重缺乏，越来越多的患者在等待供体的过程中死去〔3〕。本实验利用TissueOrganBath装置测定和比较有心跳供体(heartbeating donor,HBD)和无心跳供体(nonheartbeating donor,NHBD)肺动脉的收缩和舒张功能，探讨温缺血1 h肺用于肺移植的可行性，为NHBD肺的临床应用提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　7E型Grass多道生理记录仪、FTO3 D型张力传感器(美国Grass医疗器械公司);肌动描记仪Myograph(瑞典隆德大学医院医疗器械科定制);LEIKA WildM691型手术显微镜(瑞士Wild Leitz公司);Zeiss Stemi 1000型手术显微镜、目镜定标器(德国Zeiss公司);TM147T型双屏电子温度计(美国Electromedics公司);H18417型PH计(英国Hanna医疗器械公司);9102型PH电极(英国Thermo Orion Europe公司)。

　　1.2 动物分组与标本制作

　　健康瑞典家猪16头，体重(25.9±1.6)kg。随机分为HBD组和NHBD组，每头猪取肺动脉血管环6段。HBD组：麻醉及全身肝素化(3 mg/kg)，左侧开胸，诱导心室纤颤;以20 cm H2O的灌注压灌注4℃ LPD液(60 ml/kg);呼气末切取一小块周边肺组织，置入盛有4℃ Krebs液的培养皿中，在手术显微镜下采用不触及肺动脉的游离技术取出内径约1.5 mm的肺动脉段，用显微外科剪刀截成1.5 mm长的无分支血管环。NHBD组：诱导心室纤颤后，置于室温(约20℃)中1 h，再如上法灌注、取肺和制作标本。

　　1.3 TissueOrganBath测定

　　将肺动脉环置入器官浴槽内行等长张力测定，37℃恒温的蒸馏水通过环绕浴槽的空腔持续循环，保持浴槽内37℃恒温。选用Krebs溶液作为器官浴槽内介质〔4〕，并持续充以95%氧气和5%二氧化碳的混合气以使溶液达到生理pH值(7.40)。

　　将血管环置入浴槽液中温浴30 min后，在手术显微镜下将其挂于两个平行的L形金属挂钩上。一端挂钩连接张力传感器，并与7E型Grass Polygraph连接，持续测定血管等长张力，另一端与可移动微调装置相连，调节血管张力。将血管环在器官浴槽中平衡约2.5 h，期间每15 min更换浴槽中的Krebs溶液1次并反复牵拉血管将血管张力调节稳定至生理状态10 mN，称作基础张力。有研究表明直径1.5 mm猪肺动脉在10 mN的基础张力时可以达到最大的收缩反应〔5〕。血管张力经张力传感器放大以后，再由电子计算机数字化处理。

　　1.4 血管收缩性的测定

　　2.5 h的平衡后，加入K+浓度为124 mmol/L Krebs溶液诱导平滑肌细胞的完全去极化，测定血管最大的收缩反应能力。预实验表明，为了达到血管的最大收缩反应需要重复收缩和舒张血管。所以，当诱导的收缩达坪值后，用Krebs溶液反复冲洗直到恢复基础张力，然后再次重复此过程。以高钾Krebs溶液诱导的第二次收缩反应值作为其他收缩反应标准。高钾Krebs溶液诱导的最大收缩值<10 mN的标本被舍弃。

　　1.5 血栓烷A2受体激动剂U46619诱导的收缩反应

　　U46619是一种血栓烷A2受体激动剂，为稳定的、非内皮依赖性的血管收缩剂。浓度反应曲线显示5.7×107mol/L 的U46619可以诱导最大收缩反应值的60%～90%。在高钾Krebs溶液诱导的第二次收缩达坪值后，用Krebs溶液反复冲洗,重新平衡后，用5.7×107mol/L 的U46619诱导血管环收缩。

　　1.6 血管非内皮依赖性舒张的测定

　　在器官浴槽中加入非内皮依赖性的血管舒张剂盐酸罂粟碱，检测血管对104mol/L的罂粟碱诱导的非内皮依赖性的舒张反应。

　　1.7 统计学处理

　　高钾Krebs溶液和U46619诱导的收缩反应值通过计算基础张力和最大稳定收缩值之间的差异而得。实验数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行t检验。

　　2 结果

　　NHBD组与HBD组相比，由高钾Krebs溶液诱导的收缩反应值(mN)之间的差异(25.81±1.86 vs 26.80±1.59)无统计学意义(P>0.05);由U46619诱导的最大收缩反应值(mN)之间的差异(18.63±2.24 vs 20.23±2.09)无统计学意义(P>0.05);由U46619诱导的最大收缩反应平衡稳定后，向器官浴槽中加入罂粟碱使其浴槽内浓度达到10-4mmol/L，均能获得完全舒张，表明肺动脉血管平滑肌的舒张能力没有变化。

　　3 讨论

　　3.1 “无心跳供体”肺概念的提出

　　肺移植是挽救终末期肺部疾病患者的惟一有效途径〔6〕，但是供体的严重缺乏大大限制了其在临床上的应用。如果在循环停止后能从尸体上取得肺则不但可以缓解供体缺乏的问题，而且可以避免脑死亡对供体肺的损伤，于是，“无心跳供体”的提出成为了必然。 1991年Egan〔7〕实验证实经过1 h温缺血后狗的尸体肺仍可保持良好的气体交换功能，自2001年瑞典隆德大学医院Steen等〔8〕利用1例NHBD肺完成了肺移植的成功，对NHBD肺的研究日益受到重视〔9〕，本实验研究温缺血1 h对肺动脉平滑肌功能的影响，从而为NHBD的临床应用提供科学依据。

　　3.2 温缺血时间对“无心跳供体”肺的影响手术

　　1986年，Lechner及其同事〔10〕用从尸体中获得的肺上皮细胞进行培养，获得了成功。肺是惟一不依赖灌注进行细胞呼吸的实体器官，肺内细胞呼吸是通过气体相位差进行的;通过这一气体界面进行气体交换的主要过程是完全被动的〔11〕。因此，肺组织的代谢需求相对较低，肺实质细胞能耐受相当长一段时间的缺血。但是，肺在心跳停止后到底还能存活多久呢?不同的动物品种、不同的实验条件、不同的测定指标，使得各个实验室得出的温缺血时间限制不尽相同。一些研究认为温缺血1 h的肺仍可用作移植供体〔12，13〕，本实验将供体肺温缺血时间设计为1 h以适合目前的临床状况,观察临床工作中最可能遇到的条件下供体肺动脉的功能变化，以便为临床应用提供科学依据。

　　3.3 血管游离技术以及游离期间血管的保护

　　本实验采用“不触及血管”的游离技术，避免牵拉血管，不触及血管内膜，以防血管损伤。整个血管环制备期间，组织始终浸在4℃氧和的Krebs溶液中，这可以更好地保护血管〔4〕，减少实验误差。

　　3.4 关于实验模型

　　器官浴槽等长记录的实验模型已经被证明在血管平滑肌的功能评价方面非常可靠〔14〕。器官浴槽盛有37℃、持续氧合的Krebs溶液，为测定血管环提供一个正常的生理环境，并且为建立血管生理研究的体外模型提供了独特的可能性。

　　U46619是一种TXA2受体激动剂，本实验选其作为收缩剂有以下两个原因：首先，在预实验里，浓度反应曲线显示5.7×10-7mol/L的U46619诱导猪肺动脉发生了最大收缩反应(60%～90%);而且，无论肺动脉内皮存在与否，其诱导的收缩力相同，即其收缩反应不依赖内皮细胞的完整。其次，与其他血管收缩剂相比，U46619诱导更加持久稳定的收缩反应，当收缩达最大值后，血管张力稳定，在一定范围内上下波动(0.05～0.2 mN) ，这种稳定状态一般持续45～60 min。通过应用此浓度的U46619诱导收缩，可以建立稳定的实验条件，较好地模拟临床病理状态。

　　本实验认为温缺血1 h后肺动脉平滑肌的收缩和舒张功能保存完好。

　　【参考文献】

　　1 The Toronto Lung Transplant Group.Unilateral lung transplantation for pulmonary fibrosis〔J〕.N Engl J Med,1986;314(18)：11405.

　　2 Banner NR，Yacoub MH.Cyclosporine in thoracic organ transplantation〔J〕.Transplant Proc，2004;36(2 Suppl)：S3028.

　　3 Bando T，Date H，Minami M,et al.First registry report:lung transplantation in Japan: The Japanese Society of Lung and HeartLung Transplantation〔J〕.Gen Thorac Cardiovasc Surg，2008;56(1):1721.

　　4 Massa G，Ingemansson R，Sjoberg T,et al.Endothelium dependent relaxation after shortterm preservation of vascular grafts〔J〕.Ann Thorac Surg，1994;58(4)：111722.

　　5 Budrikis A,Liao Q,Bolys R,et al.Effects of cardioplegic flushing,storage,and reperfusion on coronary circulation in the pig〔J〕.Ann Thorac Surg,1999;67(5)：13459.

　　6 张 翀，倪一鸣，徐鹤云.大鼠同种异体左肺原位移植模型的方法改进〔J〕.中华实验外科杂志，2003;20(9)：8545.

　　7 Egan TM，Lambert CJ，Reddick R,et al.A strategy to increase the donor pool：use of cadaver lungs for transplantation〔J〕.Ann Thorac Surg，1991;52(5)：111321.

　　8　Steen S，Sjoberg T，Pierre L，et al.Transplantation of lung from a nonheartbeating donor〔J〕.Lancet，2001;357(9259)：8259.

　　9 Oto T.Lung transplantation from donation after cardiac death (nonheartbeating) donors〔J〕.Gen Thorac Cardiovasc Surg，2008;56(11):5338.

　　10 Lechner JF,Stoner GD,Y oakum GH,et al.In vitro carcinogenesis studies with human tracheobronchial tissues and cells.In：Schiff LJ,ed.In vitro models of respiratory epithelium.Boca Raton〔M〕,FL：CRC Press,1986：14359.

　　11 Wierup P，Bolys R，Steen S.Gas exchange function one month after transplantation of lungs topically cooled for 2 hours in the nonheartbeating cadaver after failed resuscitation〔J〕.J Heart Lung Transplant，1999;18(2)：1338.

　　12 Oto T，Rowland M，Griffiths AP,et al.Thirdtime lung transplant using extended criteria lungs〔J〕.Ann Thorac Surg,2007;84(2):6424.

　　13 Snell GI，Levvey BJ，Oto T,et al.Early lung transplantation success utilizing controlled donation after cardiacdeath donors〔J〕.Am J Transplant，2008;8(6):12829.

　　14 Perrault LP,Nickner C,Desjardins N,et al.Improved preservation of coronary endothelial fun