三氧化二砷和维生素C联合诱导喉癌细胞株Hep2凋亡的作用

作者：许伟民,胡劲,叶钰华

作者单位：通山县人民医院耳鼻咽喉科，湖北 通山 437600；华中科技大学同济医院耳鼻咽喉头颈外科；商业职工医院耳鼻咽喉科

       【摘要】  　　目的 探讨VitC与三氧化二砷（As2O3）促喉癌细胞株Hep2凋亡的协同效应。方法 体外培养人喉癌细胞株Hep2,以As2O3合用VitC孵育细胞，采用四甲基偶氮唑（MTT）法，AnnexinV/PI双染色流式细胞术来观察各组的细胞凋亡情况，并通过流式软件分析细胞周期变化。结果 As2O3与VitC联用能显著降低单用As2O3的细胞存活率和升高细胞凋亡率（P＜0.05），VitC能显著增强As2O3诱导细胞集中于G2/M期的作用，从而增强其促细胞凋亡作用。结论 联用VitC 能增强As2O3诱导细胞凋亡的作用，增强作用可能与影响细胞周期有关。

【关键词】  喉癌　三氧化二砷　维生素C　细胞凋亡　细胞周期

　　Effect of Combined Vitamin C with Arsenic Trioxide on the Apoptosis of Hep2 Cell Line

　　XU Weimin,HU Jin,YE Yuhua

　　(Deparment of Otolaryngology,Renmin Hospital of Tongshan County,Hubei Tongshan 437600,China)

　　ABSTRACT:Objective To study synergic effect of arsentic trioxide(As2O3) with vitamin C(VitC)on human laryngocarcinoma Hep2 cell line apoptosis.Methods Human laryngocarcinoma cell line Hep2 was cultured in vitro,and incubated with As2O3or jointly with As2O3 and VitC;the inhibition abiliy of Hep2 cells was determined by MTT,the apoptosis was mensurated by the flow cytometry with AnnexinV/PI,and the cell cycle was analyzed by FACS.Results Compared with the use of As2O3 seperately,the combinatrion of AS2O3 and VitC could increase the inhibition ability and the apoptosis rate of Hep2 cells markedly (P＜0.05）.Combination effectively enhance the change of cell cycle by As2O3;enhance cell cycle's arresting in G2 and M phase,and so enhance cell's apoptosis.Conclusion Combination of As2O3with VitC could increase apoptosis rate of Hep2 cells markedly,the effect may be related with its influence on cell cycle.    　　KEY WORDS:Laryngocarcinoma;Arsenic trioxide;Vitamin C;Apoptosis;Cell cycle

　　我国古代就有应用砒霜等砷类中药治疗包括肿瘤在内的多种恶性疾患的记载，近年来国内外应用三氧化二砷（As2O3）治疗白血病已取得令人瞩目的进展，现在人们开始尝试As2O3用于抑制实体瘤的增殖［1,2］。然而有研究发现，As2O3剂量过高时，虽在一定程度上诱导癌细胞凋亡，但同时可能对正常细胞产生细胞毒杀伤作用致细胞坏死［3］，从而限制了As2O3用于肿瘤的临床治疗。近年来一些研究者发现，当以一定剂量VitC与As2O3联用时，可使得对As2O3不敏感的HL60、U937以及K562等细胞发生凋亡，在动物实验中也可以扩大As2O3治疗白血病的作用谱［4.5］。在此基础上，本实验初步探讨了VitC与As2O3联用诱导喉癌细胞Hep2凋亡是否有协同作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验材料        　　　　喉癌细胞株Hep2由华中科技大学同济医学院实验中心提供。RPMI1640培养液（美国Hyclone公司），小牛血清（Gibicol）,As2O3分析纯购于Sigma公司，VitC由天津市精细化工开发中心提供，AnnexinV/Pi试剂盒购自晶美试剂公司。

　　1.2  检测方法

　　1.2.1  细胞培养    　　Hep2细胞在含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中贴壁生长，于37℃，5%CO2、95%O2培养箱中传代培养，每24h更换培养液一次，当细胞80%融合时传代，取传代后2d处于指数生长期细胞用于实验。

　1.2.2  实验分组    　　实验设阴性对照组、As2O3组和联用组。As2O3组终浓度分别为2.0μmol/L，4.0μmol/L，8.0μmol/L；联用组为As2O32.0μmol/L与VitC 250μmol/L组合。以上浓度为培养基终浓度。

　　1.2.3  MTT法测定细胞存活率        　　取对数生长期的Hep2细胞制成5×103个细胞/ml的悬液，每孔200μl加入96孔培养板中，培养24h后加药，每个剂量4个平行孔。在5%CO2培养箱中培养至预定时间，取出96孔板，吸出液体在每孔中加入100μl无血清培养基及0.5%MTT20μl后继续培养4h，弃上清，再加入150μlDMSO，微量震荡约10min，于自动酶标仪570nm处测定各孔OD值，重复3次，求平均值。计算存活率（%）=（实验组OD/对照组OD）×100%。

　　1.2.4  流式细胞术       　　给药培养至预定时间，用0.25%的胰酶将各组细胞消化下来，用PBS漂洗2次，加入200μl Binding Buffer 重悬细胞调整细胞浓度至106/ml，取100μl细胞悬液加入5μl AnnexinV或FITC(20μg/ml)10μl,及10μlPI(50μg/ml),室温避光孵育15min后加入400μl PBS,立即用流式细胞仪（FACSCalibur）进行流式细胞术定量检测。

　　1.3  统计学分析        　　用SAS8.1专业统计软件，计量资料的分析采用t检验，P＜0.05为差异有显著性意义。

　　2  结果

　　2.1  MTT法检测对肝癌细胞的抑制作用    　　在As2O32.0、4.0、8.0μmol/L组对细胞生长均呈不同程度的抑制，并且呈浓度依赖性，联用组细胞存活率均显著低于单用低剂量（P＜0.05），且联用组存活率能达到单用高浓度组（As2O38.0μmol/L)的水平，见图1。    　　图1 MTT法检测结果：细胞存活率变化图（略）    　　与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。柱型（1-5）代表：对照组;As2O32.0、4.0、8.0μmol/L组；联用组

　　2.2  流式细胞仪检测    　　　　细胞膜不对称丧失导致磷脂酰丝氨酸（PS）外翻发生在细胞凋亡的早期。AnnexinV/PI用于检测细胞凋亡，AnnexinV可以特异性地与PS结合而被用来检测暴露在细胞表面的PS；用PI可以区分膜的完整性。As2O3与VitC联用处理Hep2细胞后凋亡细胞群与对照组及单用As2O3相比显著增加（P＜0.01）。PI单染进行细胞周期分析可知As2O3主要诱导细胞的G2/M期细胞凋亡，VitC显著增加了As2O3诱导细胞集中于G2/M期的作用，见表1。

　　表1  流式细胞仪检测结果（略）

　　与对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.01;与As2O3组相比，△P＜0.01

　　3  讨论    　　近20年来，以顺铂为基础的诱导化疗在晚期喉癌的治疗中取得一定疗效［6］，但由于化疗药物的毒副作用及肿瘤耐药的增加，其疗效尚不令人满意。    　　细胞凋亡是生理或病理状态下的细胞自主死亡过程，它在形态上表现为细胞变圆，体积缩小，细胞核固缩，染色质浓缩边集，细胞膜表面微绒毛消失及凋亡小体的出现。研究表明诱导凋亡可能为As2O3杀伤肿瘤细胞的主要机制［7］，引起凋亡的可能机制有：①改变细胞内氧化还原状态；②开放MPT，活化caspase家族；③抑制bcl2基因，抑制NFKB活化，使胞质Ca2+浓度升高；④影响细胞周期等。    　　VitC是具有许多生物学功能的水溶性己糖衍生物，本身具有还原作用，但在不同情况下显示不同的作用：低浓度时为抗氧化作用，而高浓度时为强化氧化作用［8］。有文献报道VitC可影响肿瘤调亡相关基因P53，cmyc及bcl2的表达，抑制肿瘤细胞内DNA复合物合成，干扰肿瘤细胞代谢周期，诱导肿瘤细胞的分化，限制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡［9］。

　在体内，每天10mg As2O3静滴28d可维持血浆浓度为（0.94±0.37）mg/L，约5μmol/L。一般认为As2O3治疗浓度为1～2μmol/L。静脉应用VitC 3g/d可维持血药渡度稳定于250μmol/L,而且对人体无其他损害［10］。    　　实验结果显示，VitC与As2O3联用时表现出协同作用，细胞凋亡明显高于单用As2O3组，具有剂量依赖性。提示联用VitC可降低As2O3剂量而不影响细胞的凋亡率，如能应用于临床，有可能降低砷剂量而不影响疗效，从而减低砷剂对其他器官如胃肠道、肾脏等的毒副作用。根据本实验结果，我们认为影响细胞周期是联用VitC增强As2O3诱导凋亡的一种可能，其他相关可能机制还待进一步深入研究。

【参考文献】  　　［1］Du CW,Wen BG,Li DR,et al.Arsenic trioxidereduces the invasive and metastatic properties of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro［J］.Braz J Med Biol Res，2006,39(5):677

　　［2］刘济生，杨吉成，盛伟华,等.三氧化二砷诱导喉癌hep2细胞凋亡的初步研究［J］.苏州大学学报（医学版），2003,23（3）：289

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　　［5］徐梦麒，陆德炎，徐瑞容.维生素C与三氧化二砷联用诱导K562细胞株凋亡的研究［J］.南通医学院学报，2002,22(4):386

　　［6］De Andres L,Brunet J,LopezPousa A,et al.Function P reservation in stage Ⅲsquamous laryngeal carcinoma:results with an induction chemotheropy protocol［J］.Laryngoscpe,1995,105:822

　　［7］Andrew M E,Martin ST,Ronald BG.The potential of arsenic trioxide in the treatment of malignant diseae:past,present,and future［J］.Leukemia Research,2004,28:891

　　［8］Casciari JJ,Riordan NH,Schmidt TL,et al.Cytotoxicity of ascorbate,lipoic acid,and other antioxidants in hollow fibre in vitro tumours［J］.Br J Cancer,2001,84（11）：1544

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　　［10］Riordan NH,Riordan HD,Meng X,et al.Intravenous ascobate as a tumor cytotoxic chemotherapeutic agent ［J］.Med Hypotheses,1995,44(3):207