脑胶质瘤中FHIT、PTEN和VEGF基因表达的研究
发表时间：2012-09-14 浏览次数：1000次
作者：邵馨,陶丽丽,解晶心 作者单位：1.南京中医药大学附属常州市中医院病理科，江苏 常州 213003;2.复旦大学上海医学院病理生理学教研室, 上海
【关键词】 胶质瘤;FHIT;PTEN;VEGF;免疫组化
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，预后较差，对传统放化疗不敏感[1]，对周围脑组织有高度侵袭性，使得手术效果不尽人意。脆性组氨酸三联体基因 (Fragile histidine triad, FHIT)是Ohta[2]等于1996年从上皮癌细胞系中克隆出的一个候选抑癌基因，定位于染色体3p14.2，在人类多种肿瘤组织中该基因表达均下降。10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因 (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromoson 10, PTEN)是1997年发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。它参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞浸润、血管发生以及肿瘤转移中起到一定作用[3]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前已知最强的促血管生成因子，在肿瘤血管生成过程中起着关键性作用。本研究采用免疫组化法检测胶质瘤中FHIT、PTEN、VEGF蛋白的表达，探讨其与胶质瘤恶性程度、组织病理学分级的关系，以探讨胶质瘤的发生发展过程。
1 资料和方法
1.1 一般资料
南通大学附属医院2000～2004年手术切除的临床资料完整的胶质瘤病人60例，其中男28例，女32例，年龄15～73岁，中位年龄45.6岁。按WHO中枢神经系统肿瘤分级，Ⅱ级30例，Ⅲ级22例，Ⅳ级8例，包括星形细胞瘤48例，少突胶质瘤7例，室管膜瘤5例。另取10例非正常死亡的人脑组织蜡块作为正常对照组，由南通大学基础医学院法医学教研室提供。
1.2 主要试剂
兔抗人FHIT多克隆抗体购自Zymed公司;小鼠抗人PTEN单克隆抗体、兔抗人VEGF(A-20)多克隆抗体购自Santa Cruz公司;SP免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒购自北京中山公司。
1.3 方法
①FHIT、PTEN、VEGF检测：采用免疫组织化学法。石蜡切片常规脱蜡至水，热修复抗原;50μL 3% H2O2去离子水孵育，50μL正常非免疫动物血清孵育，滴加50μL一抗(FHIT、PTEN、VEGF 1:50稀释)，50μL 生物素标记的二抗孵育;DAB显色，脱水，透明，封片。
②结果判断标准：(1) FHIT以细胞质/核出现棕色染色为阳性，参考Gatalica[4]的H-score(H=I×P)系统对实验结果进行半定量判定，将阳性程度分为3级：阴性(-)、弱阳性(+)、强阳性(阳性(++)。(2) PTEN蛋白定位于细胞核，VEGF定位于细胞浆，以出现棕黄色颗粒为阳性, 将阳性程度分级同FHIT。
1.4 统计学处理
运用State6.0软件对相关数据资料进行统计处理。率的比较用χ2检验，当样本含量较少采用Fish确切概率法;等级资料的比较采用秩和检验，两样本的比较采用Wilcoxon法，两等级资料之间的相关分析采用Spearman等级相关检验。检验水准均采用α=0.05。
2 结果
2.1 FHIT、PTEN、VEGF蛋白表达
FHIT蛋白定位于细胞质/核(图1)，PTEN定位于细胞核(图2)。在60例胶质瘤中FHIT蛋白阳性表达率是45.0%(27/60)，PTEN蛋白阳性表达率是53.3%(32/60)。FHIT和PTEN随着胶质瘤病理分级的增高而表达下降。见表1。表1 FHIT、PTEN与胶质瘤病理分级的关系(略)
不同级别的脑胶质瘤FHIT的表达有差别(χ2=25.29，P<0.01)，其中Ⅱ级与Ⅲ级(u=4.019,P<0.05)，Ⅱ级与Ⅳ级(u=3.01, P<0.05)之间差异有统计学意义(u=-0.62,P<0.01)。PTEN的表达也有差别(χ2=24.09,P<0.01)，其中Ⅱ级与Ⅲ级(u=3.97,P<0.05)，Ⅱ级与Ⅳ级(u=3.06, P<0.05)之间差异有统计学意义.FHIT和PTEN两种蛋白表达呈正相关(rn=0.71，P<0.05)。VEGF(图3)蛋白定位于肿瘤细胞的细胞质，蛋白阳性率是76.7%(46/60)，与病理分级呈正相关，随着病理分级增加VEGF表达增加。
2.2抑癌基因FHIT、PTEN与血管因子VEGF表达相关性
在60例胶质瘤中VEGF阴性表达14例，其中PTEN阳性表达14例，FHIT阳性表达11例;在VEGF表达阳性组46例中，PTEN阳性表达18例，FHIT阳性表达16例。见表2。表2 抑癌基因FHIT、PTEN与VEGF免疫组化检测结果(略)
由表2可知， VEGF和PTEN在胶质瘤中的表达呈负相关性(χ2=15.98，P<0.05，rn=-0.52)。VEGF和FHIT的表达亦呈负相关性(χ2=8.32，P<0.05，rn=-0.37)。
3 讨论
胶质瘤的发生发展是一系列基因改变积累所致，其中抑癌基因的失活发挥了重要作用。FHIT基因是新近发现的一个抑癌基因。Ishii等[5]回顾了以前相关研究，通过分析认为，60%(1162/1948例)各种原发肿瘤的癌细胞有FHIT蛋白的缺失或明显减少。早期癌研究表明有31%的病例FHIT蛋白表达缺失或显著减少。本研究中FHIT表达率为45%，缺失率超过一半，而且FHIT表达率的下降与肿瘤病理分级呈负相关(P<0.05)，提示FHIT在胶质瘤的形成过程中可能有抑癌作用。PTEN作为一个抑癌基因，主要通过促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞浸润来发挥其抗癌作用。本研究表明PTEN阳性率为53.3%，且与病理分级呈负相关(P<0.05)。PTEN表达的下降和缺失在由低度恶性胶质瘤向多形性胶质母细胞瘤转化过程中起着十分重要的作用[6]。PTEN的C2结构域结合磷脂膜，它的突变能降低PTEN的膜亲和力及抑制细胞生长的能力。PTEN通过C2结构域控制胶质瘤细胞移行的能力是其作为抑癌基因的重要特征[7]。夏星等研究了52例不同级别胶质瘤中FHIT和PTEN基因的表达，亦发现两者呈正相关，其组织学恶性度越高，两者表达率越低[8]。VEGF是目前已知最强的促血管生成因子，在肿瘤的血管生成中起关键作用。本实验显示VEGF在肿瘤细胞和血管内皮细胞均有不同程度的表达，胶质瘤细胞阳性率为76.7%，且蛋白表达与病理分级呈正相关(P<0.05)。目前治疗胶质瘤的各种药物主要是针对抑制或杀伤肿瘤细胞本身的。VEGF是胶质瘤血管生成的关键的血管生长因子，因此通过抑制VEGF的表达来抑制胶质瘤血管生成是与常规治疗不同的一种新的治疗途径。胶质瘤中抑癌基因与肿瘤血管形成的相关性研究文献报道不多。本实验免疫组化结果显示VEGF和PTEN蛋白在胶质瘤中的表达呈负相关(P<0.05)，而VEGF与FHIT的表达也呈负相关(P<0.05)，因而推测PTEN、FHIT可能抑制了VEGF的促血管生成作用。
【参考文献】
[1]Boulay JL, Stiefel U, Taylor E, et al.Loss of heterozygosity of TRIM3 in malignant gliomas [J]. BMC Cancer,2009,9:71
[2]Ohta M,Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma associated t(3;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancers [J].Cell,1996,84(4):587597
[3]Li J, Yen C, Liaw D, et al.PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer [J]. Science, 1997, 275(5308):19431947
[4]Gatalica Z, Lele SM, Rampy BA, et al. The expression of Fhit protein is related inversely to disease progression in patient with breast carcinoma [J].Cancer,2000,88(6):13781383
[5]Ishii H, Dumon KR, Vecchione A,et al. Potential cancer therapy with the fragile histidine triad gene: review of the preclinical studies [J]. JAMA,2001,286(19):14411449
[6]Raftopoulou M, Etienne-Mannerville S, Self A, et al. Regulation of cell migration by the C2 domain of the tumor suppressor PTEN [J]. Science, 2004, 303(5661): 11791181
[7]夏星，袁先厚，江普查.FHIT、PTEN在人脑胶质瘤中的表达和意义[J].中华医学杂志,2006,30(3):163164
