磷脂酶A2受体基因多态性与脑卒中人群脂代谢的相关性研究

　　作者：李蕴博 杜丹华 吴江 王凤 郭晖 高鹏 作者单位：(吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

　　【摘要】目的 探讨磷脂酶A2受体基因多态性与脑卒中人群脂代谢的关系。方法 以rs2203053和rs4665135位点为遗传标记，应用多聚酶链限制性片段长度多态性检测756例脑卒中患者的基因型。结果 Rs2203053位点突变基因型CC+CT的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平明显高于野生基因型TT(分别为P=0.042和P=0.011)，而甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显差异(P>0.05)。Rs4665135位点突变基因型CC+CT与野生基因型TT的血脂水平无明显差异。结论 磷脂酶A2受体基因rs2203053位点多态性与脑卒中人群总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的代谢相关。

　　【关键词】 脑卒中;磷脂酶A2;基因;单核苷酸多态性(SNP)

　　目前研究发现，分泌型磷脂酶A2 (sPLA2)与低密度脂蛋白胆固醇的代谢相关，在动脉粥样硬化的过程中具有重要作用〔1～3〕,而sPLA2是磷脂酶A2受体(PLA2R)的配体，sPLA2的功能受其受体PLA2R的调节〔4〕。本研究将PLA2R基因作为候选基因，探讨其基因多态性与脑卒中人群血脂代谢的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 本研究共纳入无血缘关系的脑卒中住院患者756例，男531例，女225例，平均年龄(60.3±11.5)岁。其中脑出血113例，脑梗死643例。除外房颤、肿瘤等栓子来源的脑栓塞性疾病及肝肾功能不全、血液系统疾病，而且入院前1个月未用过调脂药物。所有入组人群均签署知情同意书，并采集全血用于DNA提取。

　　1.2 方法 选择rs2203053(Bstn I site，SNP1)和rs4665135(HaeⅢ site，SNP2)2个单核苷酸多态性位点，采用限制性酶切片段多态性的方法对SNPs基因型进行分析。DNA提取试剂盒(Promega，北京)提取基因组DNA用于PCR扩增。Rs2203053位点上游引物：5′CTCTGGAAAGGATCATAGCTTC3′,下游引物：5′AAAGCAGGTTGAACTGGTAGC3′;rs4665135位点上游引物：5′GACATGTCAGCTACGGCATA3′，下游引物：5′TGCCTGACTTATGGTTTTCC3′。

　　PCR反应体系为25 μl，其中双蒸水18 μl，10 mmol TrisHCl(pH 8.3)，50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，4种dNTP各200 μmol，引物各0.4 μmol，Taq DNA 聚合酶(Promega，北京) 1.0 U，基因组DNA 30～50 ng。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。酶切体系：rs2203053位点PCR产物以限制性内切酶(NEB，北京)于60℃水浴2～4 h酶切，rs4665135位点PCR产物以限制性内切酶(Promega，北京)于37℃水浴4～6 h酶切。经2%琼脂糖凝胶电泳(90 mV)30 min，在凝胶成像系统(上海培清科技公司)下观察结果。

　　1.3 统计学分析 应用拟和优度检验分析脑卒中人群的基因型频率的分布是否符合HardyWeinberg平衡;应用unphased遗传学软件cocaphase对等位基因频率进行分析，应用SPSS15.0软件卡方检验对计数资料进行分析，用t检验对符合正态分布的计量资料进行分析。

　　2 结果

　　2.1 PLA2R基因SNP1位点和SNP2位点多态性分析 SNP1经PCR扩增及Bstn I酶切后产生3种基因型：野生型TT纯合子、突变型CC纯合子和CT杂合子。基因型分布CC∶CT∶TT为177∶363∶216，等位基因分布C∶T为717∶795。SNP2经PCR扩增及Hae Ⅲ 酶切后产生3种基因型：野生型TT纯合子，突变型CC纯合子和CT杂合子。基因型分布CC∶CT∶TT为48∶291∶417，等位基因分布C∶T为387∶1 125。

　　对SNP1和SNP2位点的基因型进行拟和优度检验，表明群体基因型分布未偏离HardyWeinberg平衡，说明选择的样本是随机婚配的群体，适合遗传学分析。

　　2.2 SNP1位点CC+CT基因型与TT基因型体重指数、空腹血糖和血脂水平的比较 见表1。CC+CT基因型的总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平明显高于TT基因型(P=0.042和P=0.011)，而体重指数(BMI)和空腹血糖(FBG)水平无明显差异(P>0.05)。

　　2.3 SNP1位点CC+CT基因型与TT基因型体重指数、空腹血糖和血脂水平的比较 见表2。CC+CT基因型的BMI、FBG和血脂水平与TT基因型比较无显著差异(P>0.05)。

　　表1 SNP1位点的CC+CT基因型与TT基因型血脂等比较(略)

　　表2 SNP2位点的CC+CT基因型与TT基因型血脂等比较(略)

　　3 讨论

　　磷脂酶A2(PLA2)是控制脂介质前体释放的核心酶，水解包括花生四烯酸在内的游离脂肪酸和溶血磷脂的酶族〔5〕。人体内的PLA2主要分为三种：对钙离子依赖的胞质型(cPLA2)和分泌型(sPLA2)及非钙离子依赖型(iPLA2)。PLA2是磷脂类物质代谢的限速酶，除了一般性的水解功能外，其活性与功能与磷脂类代谢产物在机体内的功能密切相关。研究发现，巨噬细胞分泌的sPLA2与细胞外基质相结合，可以降解细菌、LDL和凋亡细胞〔1〕。与基质结合的PLA2可以修饰内皮下的LDL，进而导致动脉粥样硬化的形成〔2〕。另外，sPLA2还可以通过对巨噬细胞的自分泌作用上调脂肪酸合成酶活性〔3〕。这些研究表明，sPLA2与LDL的代谢是密切联系的。人类sPLA2是PLA2受体的配体，sPLA2的功能受PLA2受体的调节〔6〕。

　　PLA2R基因位于2q23q24〔4〕，其产物即M型sPLA2受体是分子量为180 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。本研究发现，PLA2R基因rs2203053位点突变基因型CC+CT的TC和LDL水平明显高于野生基因型TT，提示PLA2R基因与TC和LDLc的代谢有关。

　　目前，关于PLA2R基因与脂代谢的研究尚未见报道，而其配体PLA2基因多态性与脂代谢的研究较多。Lung等〔7〕研究发现，PLA2基因多态性与LDL水平密切相关，ApoE基因多态性与HDL相关，同时两个基因相互作用明显提高LDL水平，降低HDL水平;Wootton等〔8〕研究发现，sPLA2V和sPLA2G5基因多态性与LDL及oxLDL水平密切相关;Zhang等〔9〕研究发现，LpPLA2基因G994T多态性与LDL水平密切相关。由于sPLA2的功能受其受体PLA2R的调节，因此，本研究同样支持PLA2与脂代谢特别是LDL的代谢有关。

　　【参考文献】

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　　7 Lung FW，Kao WT，Shu BC,et al.A module map showing interaction between apolipoprotein E and phospholipase A2 polymorphism in lipid profiles〔J〕.Hum Hered，2006;62(3):13544.

　　8 Wootton PT，Arora NL，Drenos F,et al.Tagging SNP haplotype analysis of the secretory PLA2V gene，PLA2G5，shows strong association with LDL and oxLDL levels，suggesting functional distinction from sPLA2IIA：results from the UDACS study〔J〕.Hum Mol Genet，2007;16(12):143744.

　　9 Zhang SY，Shibata H，Karino K,et al.Comprehensive evaluation of genetic and environmental factors influencing the plasma lipoproteinassociated phospholipase A2 activity in a Japanese population〔J〕.Hypertens Res，2007;30(5):4039.