人脑胶质瘤特异抗原肽白介素-13α2受体重组表达质粒的构建
发表时间：2009-06-30 浏览次数：902次
作者：俞文桥
作者单位：温州医学院第一附属医院 神经外科，浙江 温州 325000
【摘要】 目的:构建白介素-13α2受体(IL-13Rα2)重组表达质粒，为检测IL-13Rα2抗原肽的表达奠定实验基础。方法:利用RT-PCR法从U251胶质瘤细胞株中获得IL-13Rα2目的基因，并与克隆质粒pMD19 Simple T载体连接转入DH5α菌克隆，用Xho I和Hind III将目的基因从克隆质粒上切下并与同样双酶切后的表达质粒pET-28a连接，转入BL21(DE3)菌，提取重组质粒进行酶切及测序鉴定。结果:目的基因IL-13Rα2与表达质粒pET-28a连接，成功构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒。结论:IL-13Rα2目的基因能经RT-PCR法获得，并能成功与表达质粒连接，构建pET-28a-IL-13Rα2重组质粒，为今后检测IL-13Rα2抗原肽的表达以及利用其来免疫治疗胶质瘤提供了良好的实验基础及理论依据。
【关键词】 胶质瘤 白细胞介素13 受体 质粒
Study on recombinant expression plasmid construction of human glioma's special antigen IL-13Rα2 YU Wen-qiao, ZHENG Wei-ming, SU Zhi-peng, WU Zhe-bao, LU Xiang-he, ZHANG Yu, YE Sheng, MAO Xiao-chun. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospitial of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325000
Abstract: Objective: To construct recombinant expression plasmid pET-28a-IL-13Rα2 that contribute to the expression of IL-13Rα2 antigen. Methods: Obtain The objective gene IL-13Rα2 from U251 glioma cell line was obtained using RT-PCR, then connect to the cloning plasmid pMD19 Simple T vector and transfer to DH5α.Digest the IL-13Rα2 from recombinant cloning plasmid using Xho I and Hind III, then connect to the expression plasmid pET-28a that was digested using the same enzymes，and convert to the BL21(DE3).At last, extract the recombinant plasmid and identify it using PCR digestion and sequencing. Results: The recombinant expression plasmid pET-28a-IL-13Rα2 was constructed successfully. Conclusion: The objective gene IL-13Rα2 can be obtained from U251 glioma cell line using RT-PCR and connect to the expression plasmid pET-28a succeed. The construction of pET-28a-IL-13Rα2 has a great conctribution not only to the expression of IL-13Rα2 antigen, but also to the immunotherapy of glioma.
Key words: glioma; IL-13; receptor; expression plasmid
近年来，随着对分子生物学及免疫治疗认识的不断提高，胶质瘤的免疫治疗不断得到重视，而IL-13Rα2作为脑胶质瘤的特异抗原肽，可由树突状细胞递呈抗原信息，激活细胞毒性T淋巴细胞来杀伤肿瘤细胞[1,2]。本研究旨在构建IL-13Rα2的表达质粒，为今后进一步检测IL-13Rα2抗原肽的表达及进行免疫治疗研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与细胞株 Trizol试剂（购自美国Invitrogen公司），Fermentas First Strand cDNA Synthesis Kit(购自MBI公司)，U251胶质瘤细胞株（购自中科院上海生物细胞研究所)，DMEM高糖培养基（购自上海生工），Ex Taq酶、Hind Ⅲ内切酶、Xho I内切酶、T4 DNA Ligase、X-Gal、IPTG、pMD19Simple T载体、DH5α菌（均购自大连宝生物公司），胶回收试剂盒、质粒小抽试剂盒（购自BBI公司），pET-28a表达质粒（购自上海捷瑞公司），BL21菌为本实验室保存。
1.2 主要仪器 细胞培养箱（HARRIS USA），超净工作台（Telstar Bio-Ⅱ-A），倒置显微镜（LEICA DMIL），PCR仪（Thermo Hgbaid），高速离心机（Saitexiangyi TDZ5-WS），全温振荡器（HZQ-FX），凝胶成像仪（BioSens SC 620），HHS型电热恒温水浴锅，DU 800 Nucleic Acid/Protein Analyzer。
1.3 方法
1.3.1 U251胶质瘤细胞培养：将胶质瘤细胞接种于含高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素）的六孔培养板中，37 ℃、5% CO2条件下进行培养，3 d传代一次。
1.3.2 RT-PCR获得IL-13Rα2目的基因：Trizol一步法从培养的胶质瘤细胞中提取总RNA，Fermentas逆转录初始链cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，并以cDNA为模板，用Ex Taq酶进行PCR扩增获得目的基因。PCR引物根据Genbank中IL-13Rα2全序列（ACCESSION NM_000640）设计，引物为上游：5'-GGCCTCGAGATGGCTTTCGTTTGCTT-3'，下游：5'-GCGAAGCTTTCATGTATCACAGAAAAATTC-3'划线处分别为 Xho I和Hind III酶切点，前三个均为保护碱基。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，再以94 ℃变性30 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。最后72 ℃延伸5 min。
1.3.3 感受态细胞的制备：挑取1μl DH5α及BL21甘油菌于5 ml LB培养基中37 ℃，220 r/min摇菌过夜，次日以1:100转接，再摇菌3 h。将菌液预冷片刻后取1.5 ml置于EP管中，以4 ℃、4 000 r/min离心10 min收集菌体，弃上清后用0.75 ml预冷的0.1 mmol/L氯化钙液悬浮细胞，冰浴放置30 min，再以4 ℃、4000 r/min离心10 min收集菌体，弃上清后用50μl冰欲冷的0.1 mmol/L氯化钙液悬浮细胞置于冰中待用。
1.3.4 克隆质粒的构建：将IL-13Rα2基因进行胶回收纯化后与pMD-19 simple T载体在16 ℃条件下连接1 h，全量的连接液加入100μl的DH5α感受态菌，42 ℃热击45 s，再置于冰中1 min，加入890μl SOC培养基，37 ℃，220 r/min震荡培养1 h，最后铺于含100μg/ml Ampicilin、24μg/ml IPTG及20 mg/ml X-Gal的LB固体培养基中，37 ℃条件下培养过夜，次日进行蓝白斑筛选，挑取白色单个阳性菌落进行PCR、酶切及测序鉴定。
1.3.5 表达质粒的构建：用Xho I和Hind Ⅲ将目的基因从克隆质粒上切下，同时对表达质粒pET-28a在37 ℃条件下双酶切3 h，并进行胶回收纯化。在16 ℃条件下，将IL-13Rα2目的基因与表达质粒体外连接过夜，转化感受态菌BL21（DE3），并铺于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，于37 ℃培养过夜，次日挑菌进行PCR、酶切及测序鉴定。
2 结果
2.1 U251胶质瘤细胞形态的观察 胶质瘤细胞在培养第2天后，呈贴壁生长，胞体较大，多形性，有多个突起，第3天后细胞密度明显增加，胞体成纤维样（见图1）。
2.2 IL-13Rα2目的基因的获得：通过RT-PCR成功获得IL-13Rα2目的基因，取5μl PCR产物1.5%琼脂凝胶电泳80mv 45 min，紫外灯下见1142 bp处有一明亮目的条带，符合理论值大小，如图2所示。同时将PCR产物胶回收纯化后进行测序，与Genbank中IL-13Rα2全序列（ACCESSION NM_000640）比对后同源性为100%。
2.3 克隆质粒构建 将IL-13Rα2目的基因与pMD-19 simple T载体连接转化DH5α菌后，见LB固体培养基生长约40个单个菌落（包括白色及蓝色菌落），挑取其中白色转化子，如图3所示，进行摇菌提质粒并用PCR、双酶切及测序鉴定后证明克隆质粒构建成功。
2.4 表达质粒构建 将IL-13Rα2用Xho I和Hind Ⅲ从克隆质粒上双酶切下与同样进行双酶切后的表达质粒pET-28a连接转化BL21(DE3)后，见LB培养基上生长约20个左右单个菌落，挑取1个单个菌落后摇菌提质粒，并用PCR、双酶切及测序鉴定后证明克隆质粒构建成功，如图4所示为酶切鉴定结果。
3 讨论
胶质瘤为颅内最具破坏力的恶性肿瘤之一，虽然近年来显微手术、放疗、化疗等治疗手段取得了长足的进步，但是胶质瘤患者的预后仍不容乐观。由于免疫治疗自身具有高选择性及长时免疫记忆的优点，而树突状细胞（Dendritic cell，DC）作为最强的专职抗原递呈细胞，在启动抗肿瘤免疫的抗原递呈中有强大的作用，因此利用DC疫苗对脑胶质瘤的免疫治疗不断得到重视[1，2]。但是多年来胶质瘤免疫治疗的抗原肽主要是以肿瘤细胞裂物和总RNA为主，由于其包括了已知和未知的众多抗原肽而容易发生自身免疫性疾病[3，4]。因此，非常有必要研究一种靶向性高，不产生自身免疫性疾病，且容易生产运输的胶质瘤特异性抗原肽，而我们的实验主要构建胶质瘤特异抗原肽的重组表达质粒，为今后胶质瘤的免疫治疗作好充分的准备。
研究表明，白细胞介素13α2受体（interleukin-13 receptorα2，IL-13Rα2）与人脑胶质瘤的发生、发展有着密切的联系，其作为一种诱骗性受体，与IL-13结合后，并不能启动IL-13依赖的JAK-STAT信号传导途径，却同时抑制了能激活此信号途径的IL-4R、IL-13Rα1二聚体与IL-13的结合，从而使得胶质细胞不断的有丝分裂，最终导致胶质瘤的形成[5]。同时，Kawakami[6]及Joshi等[7]均采用了RT-PCR和免疫组化等方法对IL-13Rα2在胶质瘤的表达作了检测，结果发现IL-13Rα2在高级别的胶质瘤中存在着特异性的高表达，在低级别胶质瘤中表达较低或不表达，正常脑组织中不表达。而我们之前用RT-PCR和免疫组化等基础研究同样显示IL-13Rα2在胶质瘤表面存在特异的表达，且与胶质瘤的级别呈正相关[8]，因此，我们可以将IL-13Rα2作为特异靶标来免疫治疗胶质瘤。
近年来，Okano等[9]实验研究显示IL-13Rα2抗原肽负载树突状细胞后可以激活HLA-A0201+ 限制的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL），从而来杀伤靶细胞。Eguchi等[10]同样用实验证明，IL-13Rα2抗原肽与树突状细胞结合后能将抗原信息递呈给T淋巴细胞，在共刺激分子B7的作用下激活HLA-A0201+限制的CD8+T细胞，最终启动细胞免疫介导的CTL反应和特殊的γ-干扰素反应来杀伤肿瘤细胞。
我们的实验显示，IL-13Rα2目的基因可以根据Genbank设计带限制性内切酶的引物，而通过RT-PCR的方法从高表达IL-13Rα2的U251神经胶质瘤细胞中获得，经过胶回收纯化后可以将其以T-A连接的方式与克隆质粒pMD-19 simple T载体体外高效连接，并将连接产物克隆入DH5α菌进行大量克隆扩增，在LB固体培养基中培养过夜后,进行蓝白斑筛选，并挑取白色重组子进行摇菌并提取重组质粒后，IL-13Rα2目的基因可以利用Xho I和Hind Ⅲ两限制性内切酶（引物上已设计此两酶的酶切位点）以双酶切的方式从重组克隆质粒上切下并纯化回收，与同样进行双酶切后的表达质粒pET-28a在T4 DNA连接酶的作用下进行体外连接，构建pET-28a-IL-13Rα2重组表达质粒，并以PCR、酶切和测序的方法进行鉴定，利用原核表达载体来构建表达质粒，技术方法成熟简便易行，并且用pET-28a来作为表达质粒，由于其带有六个组氨酸标签,有利用今后的原核表达及纯化。
通过我们的实验研究显示，重组表达质粒pET-28a-IL-13Rα2可以通过分子生物学的方法成功地在体外构建，并通过PCR、酶切及测序等方法证实，这不仅为今后IL-13Rα2抗原肽的表达奠定了坚实的实验基础，而且还为将来利用IL-13Rα2抗原肽来单抗原免疫治疗胶质瘤提供了良好的理论依据。
【参考文献】 [1] Yu JS, Liu G, Ying H, et al. Vaccination with Tumor Lysate-Pulsed Dendritic Cells Elicits Antigen-Specific,Cytotoxic T- Cells in Patients with Malignant Glioma[J]. Cancer Res, 2004, 64(14): 4973-4979.
[2] 王东海,李新钢,曲讯,等. 树突状细胞融合疫苗抗胶质瘤的实验研究[J]. 中华神经外科杂志,2006, 22(11): 699-701.
[3] 孟庆海,薄勇力,李洛,等. 树突状细胞疫苗治疗大鼠脑胶质瘤 的实验研究[J]. 中华神经外科杂志, 2006, 22(1): 55-57.
[4] 詹仁雅,童鹰,周永庆,等. 肿瘤RNA冲击致敏树突状细胞治疗G422 胶质母细胞瘤的实验研究[J]. 中华神经外科杂志, 2003, 19(2): 99-102.
[5] Kawakami M, Taguchi J, Murata T, et al. The interleukin-13 receptor alpha2 chain: an essential component for binding and internalization but not for interleukin-13-induced signal transduction through the STAT6 pathway[J]. Blood, 2001, 97(9): 2673-2679.
[6] Kawakami M, Kawakami K, Takahashi S, et al. Analysis of interleukin-13 receptor alpha2 expression in human pediat- ric brain tumors[J]. Cancer, 2004, 101(5): 1036-1042.
[7] Joshi BH,Plautz GE, Puri RK. Interleukin-13receptor alpha chain:a novel tumor-associated ransmembrane protein in pri- mary explants of human malignantgliomas[J].Cancer Res, 2000, 60(5): 1168-1172.
[8] 郑伟明,章剑剑,李剑敏,等.星形细胞瘤IL-13Rα2的表达及其与预后的关系[J]. 中华神经外科杂志, 2006, 22(5): 324.
[9] Okano F, Storkus WJ, Chambers WH, et al. Identification of a Novel HLA-A*0201- restricted, Cytotoxic T Lymphocyte Epitope in a Human Glioma-associated Antigen, Interleukin 13 Receptor -2 Chain[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(9): 2851- 2855.
[10]Eguchi J, Hatano M, Nishimura F, et al. Identification of Interleukin-13 Receptor A2 Peptide Analogues Capable of Inducing Improved Antiglioma CTL Responses[J]. Cancer Res, 2006, 66(11): 5883-5891.
