TNP-470对Wistar大鼠C6胶质瘤细胞抑制作用的体内实验研究

　　作者：于天浩 葛鹏飞 罗毅男 金鑫 作者单位：吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨TNP-470对Wistar大鼠C6胶质瘤细胞的抑制作用。方法 培养C6细胞，建立动物荷瘤模型。荷瘤后将Wistar大鼠随机分为肿瘤对照组 (0.9%氯化钠注射液30 mg/kg隔日1次，共6次皮下注射)、TNP-470组 (TNP-470 30 mg/kg隔日1次，共6次皮下注射)、顺铂组(顺铂5 mg/kg每周2次，共4次腹腔内注射)、联合给药组(TNP-470 15 mg/kg隔日皮下注射，共6次;同时顺铂2.5 mg/kg腹腔内注射，每周2次，共4次)，每组15只。观察不同的药物对肿瘤生长的影响。结果 与对照组相比，TNP-470治疗组肿瘤重量及最大横径显著降低(P<0.001); TNP-470治疗组及联合给药组G0/G1期细胞数显著高于对照组(P< 0.01)，而TNP-470治疗组G0/G1期细胞数明显高于联合治疗组(P<0.01);TNP-470治疗组、联合给药组及顺铂治疗组G2/M期、S期细胞数显著低于对照组(P< 0.01)。与肿瘤对照组相比，联合给药组和顺铂治疗组及TNP-70组胶质瘤细胞凋亡百分率显著升高(P<0.01);TNP-470治疗组胶质瘤细胞凋亡百分率显著高于联合治疗组(P<0.01)。结论 TNP-470是一种对胶质瘤有明显疗效的化疗药物，可明显抑制肿瘤生长，使肿瘤重量减轻，同时对大鼠本身体重影响小，行为学症状改变出现较少，疗效明显优于顺铂。

　　【关键词】 TNP-470;胶质瘤

　　胶质瘤是神经系统最常见的一种恶性肿瘤，呈浸润性生长，与正常脑组织无明显分界，手术难以彻底切除，因此术后进行放化疗及免疫治疗显得尤为重要〔1〕。近年来研究表明，肿瘤的生长和转移与其新生血管形成有密切关系。作为抗肿瘤治疗的新方向，血管生成抑制剂受到越来越多的关注，尤其具有高效低毒特性的血管生成抑制剂更被认为是目前最有发展前途的抗肿瘤药物〔2〕。本研究通过研究TNP-470对大鼠C6胶质瘤细胞的抑制作用，旨在探讨其对胶质瘤的抑制效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康雌性Wistar大鼠60只，鼠龄5～ 6 w，体重160～180 g，购于吉林大学实验动物中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂、仪器与药品 TNP-470〔0-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇〕、 AGM-1470购于长春市天诚医药公司;顺铂购自齐鲁制药厂;IMDM培养液购自美国Gibco公司。

　　1.2.2 细胞株培养 大鼠C6脑胶质瘤细胞株由吉林大学基础医学院生理教研室提供。置37℃、5% CO2孵箱中传代培养。将C6大鼠脑胶质瘤细胞株复苏成功后，用含10%胎牛血清的IMDM培养液培养(含100 U/ml青霉素和链霉素)，当细胞增殖进入对数阶段，用0.25%胰酶消化细胞并制成细胞悬液。细胞活力以台盼蓝排斥试验检测。

　　1.2.3 动物荷瘤模型的建立 收集对数生长期生长状态良好的C6细胞(调细胞浓度为1.0×106/ml，细胞存活率达90%以上)，以5×106个细胞/鼠的量接种，所有的大鼠均注入右前腋皮下，注入量不超过0.5 ml培养液，以防止注入过多外溢。

　　1.2.4 给药方法 荷瘤后将全部Wistar大鼠随机分为4组，每组15只，第3天开始药物治疗。具体如下：① 肿瘤对照组：0.9%氯化钠注射液(30 mg/kg)，隔日1次，共6次，皮下注射。② TNP-470组：TNP-470(30 mg/kg)，隔日1次，共6次，皮下注射。③ 顺铂组：顺铂(5 mg/kg)，2次/w，共4次，腹腔内注射。④ 联合给药组：TNP-470以15 mg/kg隔日皮下注射1次，共6次;同时给予顺铂2.5 mg/kg腹腔内注射，2次/w，共4次。

　　1.2.5 TNP-470对肿瘤生长的影响 在药物治疗期间，通过测量肿瘤最大横径观察肿瘤的生长情况，同时观察大鼠对药物的毒副反应情况。

　　1.2.6 TNP-470对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响 肿瘤移植2 w后停药，断头处死动物，立即取出肿瘤组织，测量肿瘤横径、称量其重量。取部分肿瘤组织研磨成单细胞悬液，计数后将细胞终浓度调成1×107个细胞/ml，取2×106个细胞，快速加入5 ml 70%冷乙醇于4℃下固定12 h以上，用于增加细胞膜的通透性。然后用PBS洗涤细胞，1 500 r/min离心5 min，重复2次后加入0.05 mg/ml的PI(碘化丙锭)400 μl，0.1 mg/ml的RNA酶100 μl，避光反应30 min后直接上机，每份样品检测1×104/ml个细胞。采用美国COULER公司生产的ELITE型流式细胞仪，激发光源为15 mw氩离子激光，波长488 nm，应用FACS软件，收集细胞，LYSIS软件分析处理资料，用累积曲线分割法计算其细胞所占比例，记录细胞周期和凋亡百分率。

　　1.2.7 肿瘤血管密度、细胞凋亡观察 断头处死动物取部分组织置于10%福尔马林中固定，经系列酒精脱水，二甲醛透明后进行石蜡包埋，切片，厚5 μm，60℃2 h后备用。将组织切片经二甲醛脱蜡，系列酒精脱水后苏木精染色，盐酸酒精分色后，浸入伊红染液中，蒸馏水冲洗后，系列脱水，二甲苯透明封片。HE染色，光镜下观察肿瘤血管密度、电镜下观察细胞凋亡。

　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示，组间比较采用Student′s t检验。

　　2 结果

　　2.1 TNP-470对大鼠一般状态的影响 联合给药组大鼠体重较对照组明显下降(P<0.001)，顺铂治疗组体重减轻现象更加明显(P<0.01)。而TNP-40组大鼠体重较联合治疗组及顺铂治疗组显著升高(P<0.01)，与肿瘤对照组接近。见表1。

　　表1 不同药物治疗后大鼠体重的变化(略)

　　与对照组比较：1)P< 0.01，2)P<0.001;与联合治疗组比较：3)P<0.01;与顺铂治疗组比较：4)P<0.01

　　2.2 TNP-470对肿瘤生长的影响 与肿瘤对照组相比，顺铂治疗组和联合给药组肿瘤重量及最大横径显著降低(P<0.001);TNP-470治疗组尤为显著(P<0.01)。见表2。

　　2.3 TNP-470对荷瘤大鼠肿瘤细胞周期及凋亡的影响 见表3。TNP-470治疗组及联合给药组G0/G1期细胞数显著高于对照组(P< 0.01)，而TNP-470治疗组G0/G1期细胞数明显高于联合治疗组(P<0.01);TNP-470治疗组、联合给药组及顺铂治疗组G2/M期、S期细胞数显著低于对照组(P<0.01)。与肿瘤对照组相比，联合给药组和顺铂治疗组及TNP-70组胶质瘤细胞凋亡百分率显著升高(P<0.01);TNP-470治疗组胶质瘤细胞凋亡百分率显著高于联合治疗组(P<0.01)。

　　表2 不同药物治疗后大鼠肿瘤最大横径和重量的变化(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.001

　　表3 TNP-470对荷瘤大鼠肿瘤细胞凋亡的影响(略)

　　与对照组比较：1)P<0.01;与联合治疗组比较：2)P<0.01

　　2.4 TNP-470对荷瘤大鼠肿瘤细胞VEGF蛋白表达的影响 免疫组化法检测不同药物治疗后肿瘤组织中VEGF蛋白表达的变化，其中阳性细胞百分率在对照组、联合治疗组、顺铂治疗组及TNP-470治疗组分别为(35±3.33)%、(27±1.71)%、(21±1.35)%、(13±0.93)%。其中TNP-470治疗组、顺铂治疗组及联合治疗组VEGF蛋白阳性细胞百分率均显著低于肿瘤对照组(P<0.01);而TNP-470治疗组VEGF蛋白表达百分率显著低于联合治疗组和顺铂治疗组(P<0.01)。

　　2.5 TNP-470对荷瘤大鼠肿瘤血管密度的影响 对照组镜下血管壁光滑，细胞排列整齐，无紊乱现象。联合给药组见血管壁较光滑，单位视野下血管密度减少。顺铂治疗组镜下单位面积血管密度与对照组相比无明显变化。TNP-470治疗组镜下单位面积血管密度明显减少。电镜下观察可见各组均有不同程度的凋亡现象。表现为肿瘤细胞膜局部破损，胞膜泡状化，微绒毛消失，胞内线粒体轻度肿胀，凋亡小体形成，细胞核呈不规则形，呈固缩状，染色质趋边、浓缩。

　　3 讨论

　　肿瘤细胞诱导分泌的化学介质，是引起微血管通透性增加和病理性微血管生长的重要因素而在这些化学介质中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)被认为是作用最强、特异性最高的调控因子〔3，4〕。本研究通过免疫组织化学染色及镜下观察VEGF的表达情况，发现TNP-470治疗组VEGF表达明显下降，血管密度明显降低。说明TNP-470具有抑制血管再生和拮抗VEGF的作用。

　　顺铂是目前临床上常用的对胶质瘤有明显疗效的一种化疗药物，但其肾毒性、致耳聋性、骨髓抑制、消化道反应等副作用比较强烈。而TNP-470也是一种对胶质瘤有明显疗效的化疗药物，可明显抑制肿瘤生长，使肿瘤重量减轻，同时对大鼠本身体重影响小，行为学症状改变出现较少,疗效明显优于顺铂。

　　本实验还发现，在没有其他因素干预的情况下，胶质瘤细胞有轻度的凋亡(7.76%)，给予顺铂治疗可以促进肿瘤细胞凋亡(12.56%)，当给予TNP-470治疗后，明显促进肿瘤细胞凋亡(23.5%)。应用流式细胞术同时观察不同治疗方案对胶质瘤细胞周期的影响，发现TNP-470治疗组G0/G1期细胞百分率明显高于对照组，而S期细胞百分率明显低于对照组，这与以往文献报道的TNP-470具有抑制胶质瘤细胞DNA合成，从而抑制细胞增殖，即诱导G0/G1阻滞的作用相吻合。

　　本研究结果表明，TNP-470不但通过抑制VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管再生，也具有明显的促进胶质瘤细胞凋亡的作用。其疗效强于目前临床化疗药物——顺铂，同时极大减少了顺铂强烈的副效应。因此，我们预测TNP-470治疗脑胶质瘤有良好的临床应用前景。

　　【参考文献】

　　1 Zhang H，Wu Y，Tao Y,et al.Reconstruction of anterior skull base defect by pedicle frontal muscle compound flap〔J〕.Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi，2002;37(5):370-2.

　　2 O′Byrne KJ，Steward WP.Tumour angiogenesis：a novel therapeutic target in patients with malignant disease〔J〕.Expert Opin Emerg Drugs.2001;6(1):155-74.

　　3 Wang XF，Tu LF，Wang LH,et al.Inhibition of expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in pulmonary adenocarcinoma cell by TNP-470 in combination with gemcitabine〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2006;7(10):837-43.

　　4 Ueno Y.Implication of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human head and neck cancer〔J〕.Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho，2006;109(3):163-70.