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    《神经外科学》

    腺病毒介导的IL24基因抑制人脑胶质瘤细胞增殖的机制研究

    发表时间：2010-07-06  浏览次数：495次

    　　作者：张铁军，袁志诚，张严，赵婷婷，王青，叶思思, 李巧玉，湛利平，杨勇，金洁，邵根宝，彭琬昕，龚爱华 作者单位：江苏大学 附属人民医院神经外科， 江苏 镇江, 212002; 基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212013

    　　【摘要】目的： 探讨IL24抑制人脑胶质瘤细胞增殖的可能机制。方法： 用腺病毒介导的IL24(Ad.IL24)及腺病毒空载体感染人脑胶质瘤细胞U251，通过荧光显微镜观察腺病毒的感染效率，RTPCR法检测IL24的转录水平;用MTT法、流式细胞仪检测IL24对U251细胞增殖的影响;用蛋白质印迹方法检测神经生长因子(NGF)、酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase A, TrkA)的表达水平，并分析其相关性。结果： Ad.IL24及腺病毒空载体转染U251后，RTPCR结果显示Ad.IL24组出现高表达电泳条带，而腺病毒空载体组则未出现电泳条带;MTT结果显示Ad.IL24明显抑制了U251细胞的增殖，且流式细胞仪细胞周期检测发现Ad.IL24处理组较对照组G2/M期明显延长，蛋白质印迹结果显示过表达IL24的U251细胞中NGF及TrkA表达降低。结论: IL24可能通过减少细胞中TrkA和NGF的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。

    　　【关键词】 白细胞介素24; 神经生长因子; 酪氨酸激酶受体A; 增殖; 胶质瘤细胞

    　　Adenovirus mediated IL24 suppress proliferation of glioma cells　by decreasing NGF/TrkA expression

    　　ZHANG Tiejun, YUAN Zhicheng, ZHANG Yan, ZHAO Tingting, WANG Qing, YE Sisi, LI Qiaoyu,ZHAN Liping, YANG Yong, JIN Jie, SHAO Genbao, PENG Wanxin, GONG Aihua

    　　(Department of Neurosurgery, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China)

    　　[Abstract]Objective: To investigate the effect of AdIL24 on proliferation of glioma cells and explore its probable mechanism. Methods： U251 were infected with AdIL24; Microscope was used for observing the infection efficiency, and RTPCR for examining the transcription level of IL24, MTT and FACS for investigating the effect of IL24 on the proliferation of U251, Western Blot for detecting expression of nerve growth factor(NGF) and tyrosine kinase A(TrkA) and analyzing association between them. Results: All of the methods revealed that IL24 expressed well in U251 cells and inhibited the proliferation of U251 significantly. G2/M phase was prolonged by IL24 also. Moreover, overexpression of IL24 result in decreasion of NGF and TrKA.Conclusion: IL24 mediated inhibition of the proliferation of human glioma cells was resulted from decreasing expression of NGF and TrKA.

    　　[Key words]IL24; nerve growth factor; tyrosine kinase A; proliferation; glioma cell line

    　　神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，患者生存期短，复发及死亡率高，而且肿瘤具有高增殖能力和易侵袭性的特点，是临床上治疗的难点。目前，手术、放化疗效果均不理想。因此，探索新的治疗途径尤为必要。目前，基因治疗被认为是具有应用前景的治疗手段之一，而选择合适的目的基因是基因治疗的关键。研究发现白细胞介素24(IL24)基因能抑制多种肿瘤细胞的生长，如肺癌、乳腺癌、鼻咽癌及前列腺癌细胞[1]，腺病毒介导的IL24(Ad.IL24)转染肿瘤细胞后，均可抑制肿瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡[2]。此外，已有大量研究表明，神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及其受体酪氨酸激酶受体A(tyrosine kinase A, TrkA)在多数实体瘤包括脑胶质瘤中高表达，且与肿瘤的恶性程度密切相关[3-4]。Ad.IL24抑制肿瘤细胞的增殖是否与NGF/TrkA的表达水平有关尚不清楚。因此，在本研究中, 我们用Ad.IL24作用于人脑胶质瘤细胞, 观察其对癌细胞增殖的影响，并检测NGF及其受体TrkA的变化，探讨Ad.IL24调控癌细胞增殖的机制。

    　　1 材料和方法

    　　1.1 材料

    　　Ad.IL24及腺病毒空载体由苏州大学医学院细胞与分子生物学教研室杨吉成教授馈赠;人脑胶质瘤U251细胞株(中国科学院上海生命科学研究所细胞库);小牛血清(杭州四季青公司);DMEM培养基(GIBCO);兔抗NGF多克隆抗体(Santa Cruz);兔抗TrkA多克隆抗体(Santa Cruz);IL24引物: hIL24上游5′CTTTGTTCTCATCGTGTCACAAC3′，hIL24下游：5′TCCAACTGTTTGAATGCTCTCC3′，由上海生工生物科技有限公司合成。

    　　1.2 方法

    　　1.2.1 细胞培养

    　　用含10%小牛血清的DMEM培养基培养U251细胞，置CO2培养箱内(37 ℃，5 %CO2)培养。当细胞铺满瓶底时进行消化、传代。

    　　1.2.2 荧光显微镜观察Ad.IL24感染效果

    　　腺病毒按照常规方法扩增，分别以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400稀释比例的Ad.IL24感染U251　细胞，48 h后通过荧光显微镜观察GFP的表达，并以此选择最佳感染浓度。

    　　1.2.3 RTPCR方法检测IL24转录表达水平

    　　Ad.IL24感染U251细胞48 h后，收获1×105细胞，离心沉淀，提取总RNA，按照试剂盒说明书做逆转录，用IL24的引物做PCR检测，PCR的反应条件为94 ℃ 4 min，94 ℃ 50 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min，35 个循环，72 ℃ 10 min。

    　　1.2.4 MTT 法检测Ad.IL24对U251 细胞增殖的影响

    　　用含10%小牛血清的DMEM 配成浓度为1 ×105/ml的细胞悬液，加入96 孔培养板，每孔100 μl，37℃、5% CO2孵育过夜后，分别按终浓度1∶50，1∶100，1∶200，1∶400加入 Ad.IL24及腺病毒空载体作为对照，每组设3个复孔，37℃、5 % CO2孵育72 h后，每孔加MTT(5 mg/ml) 10 μl，继续孵育4 h后加入溶解剂10 % SDS，1% HCl(1 mol/L),每孔100 μl，37℃ 孵育，6 h后在酶联免疫检测仪上测D(570 nm)值，并计算相对增殖率。

    　　1.2.5 流式细胞仪检测 Ad.IL24处理对U251细胞周期的影响

    　　将U251细胞种在6孔板中，24 h后，加入Ad.IL24及腺病毒空载体，培养48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤2次,各加入1 ml的PBS重新悬浮细胞并计数,制成约1 ×106/ml的单细胞悬液0.5 ml，迅速加入到4 ml 70%的冷乙醇中，充分混匀，4℃ 下固定24 h，用流式细胞仪观察Ad.IL24处理对U251细胞周期的影响。

    　　1.2.6 蛋白质印迹检测Ad.IL24感染U251细胞后的NGF，TrkA表达水平

    　　Ad.IL24 感染U251细胞48 h后，收集细胞，PBS 洗2次，加入裂解缓冲液，冰上放置30 min。然后在4℃ 下，15 000 ×g离心15 min，收集样品并与上样缓冲液一起煮沸10 min，进行SDSPAGE电泳，再将凝胶蛋白转印到硝酸纤维膜上，经5 %脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗室温孵育2 h，TBST缓冲液洗3次，再加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1 h，ECL发光液作用1 min后以分子成像系统扫描仪记录实验结果，并进行定量分析。

    　　2 结果

    　　2.1 IL24基因在U251细胞中的表达

    　　Ad.IL24感染U251细胞48 h后，荧光显微镜观察细胞，Ad.IL24在浓度1∶200时感染效率达95%以上(见图1a)。RTPCR结果显示, Ad.IL24感染U251细胞组在621 bp处出现高表达电泳条带，而腺病毒空载体组则未出现电泳条带，表明IL24在U251 细胞中过表达，见图1b。

    　　2.2 Ad.IL24对U251 细胞增殖能力的影响

    　　腺病毒空载体和Ad.IL24按照不同的浓度(1∶50～1∶400)感染U251 细胞，72 h后，用MTT方法分析U251 细胞相对增殖率,结果见图2。

    　　图2表明随着浓度的降低细胞相对增殖率增加，当达到1∶400时，相对增殖率接近对照组。高浓度(1∶50，1∶100)感染细胞后，在48 h后在倒置显微镜下(数据未给出)可见多数细胞死亡，所以相对增殖率较低。因此，我们在下列实验中使用1∶200的稀释度。

    　　2.3 Ad.IL24对U251细胞周期的影响

    　　通过流式细胞仪检测Ad.IL24处理U251细胞48 h发现，腺病毒空载体组G2/M期为(6.15±0.004)%，Ad.IL24处理组G2/M期为(22.71±0.020)%，Ad.IL24转染U251细胞后，其G2/M 期细胞比例明显增高，提示细胞被阻滞在G2/M 期，见图3。

    　　2.4 Ad.IL24对NGF，TrkA表达水平的影响

    　　Ad.IL24感染U251细胞48 h后，蛋白质印迹法检测显示TrkA和NGF的表达水平明显降低，但Ad.IL24对NGF的表达水平影响相对较小，可能是因为Ad.IL24早期感染细胞24 h内， NGF已表达且暂时储存在细胞内所致(图4)。

    　　3 讨论

    　　IL24基因是Jiang等[5]发现并命名的，又称之为mda7基因 (melanomadifferentiationassociated gene)，属于IL10家族。IL24能抑制多种肿瘤细胞的生长[2]，还可以抑制肿瘤血管的生成、促进细胞凋亡等[6]。IL24抑制肿瘤细胞增殖的功能与前凋亡基因BAX上调及BAX/BCL2 的比值有关[2,7]。Ramesh等[6]研究还发现IL24既抑制了血管内皮细胞的分化，又抑制了由血管内皮生长因子和成纤维母细胞生长因子诱导的内皮细胞迁移。这些研究表明IL24是一个可用于肿瘤基因治疗的抑癌基因。

    　　此外，NGF/TrkA在多数实体瘤中的高表达，与肿瘤的发生、发展相关，甚至与不良预后有关[8-10]。国内外的研究表明TrkA可以作为抗肿瘤的药物靶点，目前针对TrkA的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)CEP701已经进入Ⅱ期临床试验阶段[11]。王向鹏等[12]对人脑胶质瘤手术标本进行了NGF免疫组化染色，证实了NGF在人脑胶质瘤中过表达，其阳性程度与胶质瘤的恶性程度密切相关。Singer等[4]发现外源性神经生长因子还可以促进人脑胶质瘤细胞株U251，U87，U373细胞的增殖，且呈剂量依赖性。因此，NGF/TrkA已经成为肿瘤包括脑胶质瘤治疗的靶点。然而，IL24是否能抑制NGF/TrkA在肿瘤细胞内的表达，从而影响肿瘤细胞的增殖能力呢?

    　　在本研究中，我们首先用Ad.IL24感染脑胶质瘤细胞，通过多种手段分析了其对U251细胞增殖能力的影响。在此基础上，我们进一步检测了TrkA和NGF的表达水平。初步的实验结果表明，Ad.IL24通过抑制TrkA/NGF的表达从而影响肿瘤细胞的增殖，这可能是IL24抗肿瘤作用的机制之一。至于IL24是通过何种信号转导途径影响细胞周期的进程，甚至导致肿瘤细胞的凋亡，还有待进一步的研究。

    　　【参考文献】

    　　[1]Jiang H, Su ZZ, Lin JJ, et al. The melanoma differentiation associated gene mda27 suppresses cancer cell growth [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(17):9160-9165.

    　　[2]Novakova Z, Hubackova S, Kosar M, et al. Cytokine expression and signaling in druginduced cellular senescence [J]. Oncogene, 2010, 29(2):273-284.

    　　[3]Zhang Z, Yang Y, Gong A, et al. Localization of NGF and TrkA at mitotic apparatus in human glioma cell line U251 [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,337(1):68-74.

    　　[4]Singer HS,Hansen B,Martinie D,et al. Mitogenesis in glioblastoma multiforme cell lines:a role for NGF and its TrkA receptors [J]. J Neurooncol,1999, 45(1):1-8.

    　　[5]Jiang H,Su ZZ,Boyd J, et al.Gene expression changes associated with reversible growth suppression and the induction of terminal differentiation in human melanoma cells [J]. Mol Cell Differ,1993, 1(1):41-66.

    　　[6]Ramesh R, Mhashilkar AM, Tanaka F, et al. Melanoma differentiation associated gene 7/Interleukin(IL)24 is a novel ligand that regulate abiogenesis via the IL22 receptor[J]. Cancer Res, 2003, 23(16):5105-5113.

    　　[7]Sarkar D, Su ZZ, Lebedeva IV, et al. Mda7(IL24): signaling and functional roles[J]. Biotechnique, 2002,supple:30-39.

    　　[8]Rubin JB, Segal RA. Growth, survival and migration: the Trk to cancer[J]. Cancer Treat Res,2003，115:1-18.

    　　[9]McGregor LM, McCune BK, Graff JR, et al. Roles of trk family neurotrophin receptors in medullary thyroid carcinoma development and progression[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999,96(8):4540-4545.

    　　[10]Assimakopoulou M, Kondyli M, Gatzounis G, et al. Neurotrophin receptors expression and JNK pathway activation in human astrocytomas[J].BMC Cancer, 2007,7:202.

    　　[11]Collins C, Carducci MA, Eisenberger MA, et al.Preclinical and clinical studies with the multikinase inhibitor CEP701 as treatment for prostate cancer demonstrate the inadequacy of PSA response as a primary endpoint[J]. Cancer Biol Ther, 2007, 6(9):1360-1367.

    　　[12]王向鹏,杨智勇,王廷华,等. 神经生长因子和脑源性神经营养因子在脑胶质瘤内的表达[J]. 国际神经病学神经外科学杂志,2006,33(2):99-102.