EGFR和Cyclin D1的联合表达预测胶质瘤的放疗敏感性

　　作者：崔刚，张熙，周乐，屈建强，刘鹏斌 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院神经外科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院神经外科，陕西西安 710061;3. 第二附属医院麻醉科，陕西西安 710004

　　【摘要】目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)和Cyclin D1蛋白的表达与胶质瘤放疗敏感性的关系。方法 采用免疫组织化学方法检测EGFR和Cyclin D1蛋白在53例不同放疗敏感性胶质瘤和10例正常脑组织中的表达。结果 EGFR或Cyclin D1蛋白的表达与胶质瘤的放疗敏感性均无统计学意义(P>0.05)。EGFR和Cyclin D1蛋白的联合表达与胶质瘤的放疗敏感性具有统计学意义(P<0.05)。结论 EGFR和Cyclin D1蛋白的联合表达可预测胶质瘤的放疗敏感性。

　　【关键词】 EGFR蛋白;Cyclin D1蛋白;脑胶质瘤;放疗敏感性

　　redicting the radiosensitivity of glioma

　　Cui Gang, Zhang Xi, Zhou Le, Qu Jianqiang, Liu Pengbin

　　(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Neurosurgery,the first Affiliated Hospital, Medical School of Xi an Jiaotong University, Xian 710061;3. Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and Cyclin D1 protein and the radiosensitivity of human glioma. Methods The expression of EGFR and Cyclin D1 was detected by SP immunohistochemical technique in brain glioma (n=55) and normal brain tissues (n=10). Results There was no relationship between the expression of EGFR protein and the radiosensitivity of human glioma, so was the Cyclin D1 protein. But the expression of EGFR and Cyclin D1 protein was correlated with the radiosensitivity of human glioma. Conclusion The expression of EGFR and Cyclin D1 might serve as an indicator of radiosensitivity in human glioma.

　　KEY WORDS: epidermal growth factor receptor (EGFR) protein; Cyclin D1 protein; glioma; radiosensitivity

　　放射治疗是治疗胶质瘤的重要手段。不同组织类型的胶质瘤其放射敏感性不同，一般认为由高到低依次为髓母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤及胶质母细胞瘤[1]。在星形细胞瘤中，低级别的星形细胞瘤较高级别的星形细胞瘤对放疗更为敏感[2]。当前理论认为，胶质瘤的分子特征是决定放射敏感性的重要因素。本文拟应用免疫组织化学技术，探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、Cyclin D1蛋白在脑胶质瘤组织中的表达，了解其与胶质瘤放疗敏感性之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　研究对象为西安交通大学医学院第二附属医院2002-2004年期间收治的53例胶质瘤患者，经手术病理证实，且随访资料完整。所有标本均经100mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋后存档。其中星形细胞瘤42例，多形性胶质母细胞瘤6例，少枝胶质细胞瘤5例。病例中男27例，女26例，年龄4-71岁，平均40.3岁。术前均未行放疗或化疗。按照胶质瘤对放疗敏感性从高到低将标本分为少枝胶质细胞瘤组，Ⅰ-Ⅱ级星形细胞瘤组，Ⅲ-Ⅳ级星形细胞瘤组和胶质母细胞瘤组。另10例正常对照脑组织取自我院因颅脑损伤行内减压术的患者，男女各5例，年龄10-65岁，平均36.5岁。其固定、包埋、切片程序同前。其中正常脑组织无胶质细胞增生，无细胞坏死和水肿。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　鼠抗人EGFR单克隆抗体购自Canta cruze公司，工作浓度1∶25，鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体购自Cell Signaling公司，工作浓度1∶400，广谱SP试剂盒购自深圳晶美生物技术有限公司。采用链霉素抗生物素过氧化物酶法(SP法)检测蛋白表达。每次实验以PBS代替一抗作为空白对照，由试剂公司提供阳性对照片。实验操作按试剂盒说明书进行。

　　1.3 观察与测定方法

　　EGFR蛋白以胞质染色为棕褐色颗粒者为阳性细胞，Cyclin D1蛋白以胞核或胞质染色棕褐色为阳性细胞。400倍显微镜下每张载玻片计数500个细胞，依据染色阳性细胞数，计算阳性细胞所占百分比：阴性：<10%(-);弱阳性：10%-25%(+);阳性：26%-50%();强阳性：>50%()。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS 11.5统计软件进行分析。用卡方检验、校正卡方检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 EGFR蛋白和CyclinD1蛋白在脑胶质瘤中的表达

　　EGFR蛋白在人脑胶质瘤中的阳性着色定位于细胞质(图1)，CyclinD1蛋白在人脑胶质瘤中的阳性着色定位于细胞核(图2)。正常脑组织中未见表达。

　　2.2 EGFR蛋白和Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的表达

　　表1可见EGFR蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的表达无统计学意义(P=0.06)，Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的表达也无统计学意义(P=0.39)。表1 EGFR和Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的表达(略)

　　2.3 EGFR蛋白、Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤的共表达

　　EGFR蛋白和Cyclin D1蛋白的共表达在不同放疗敏感性胶质瘤中有统计学意义(P=0.045，表2)。表2 EGFR和Cyclin D1蛋白在胶质瘤中的共表达(略)

　　3 讨论

　　胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤。据统计，在美国的颅内原发性肿瘤患者中，40%为胶质瘤，其中大部分为恶性胶质瘤。恶性胶质瘤患者复发率高，预后很差，对社会和家庭的危害极大。放疗是胶质瘤治疗中最重要的辅助治疗手段。但是，不同组织类型的胶质瘤其放射敏感性不同，即使同类同一级别也存在放射敏感性的差别，加之放疗本身存在很多副作用，如脑水肿、骨髓抑制等。因此，预测胶质瘤的放疗敏感性具有重要的意义。

　　3.1 EGFR蛋白、Cyclin D1蛋白与胶质瘤放疗敏感性的关系

　　EGFR是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体，其编码基因定位于7p1113，当与其配体结合后，可通过自身磷酸化使其激活，进而激活细胞内一系列的信号通路[3]。有学者认为，EGFR的表达能抑制胶质瘤的放疗敏感性。Sherry AW等将EGFR质粒转染入U373胶质瘤细胞株，研究其放疗敏感性时发现：EGFR质粒转染组的克隆形成率是未转染组的2倍，将U373胶质瘤细胞株制成荷瘤鼠模型，放疗后发现，EGFR转染组的肿瘤体积是未转染组的3.5倍[4]。但是，也有学者认为，EGFR蛋白与胶质瘤的放疗敏感性并无明显关系。Sarkaria JN等用13种胶质瘤细胞株分别接种于裸鼠体内制成13种裸鼠胶质瘤模型，放疗后有6种胶质瘤裸鼠模型的生存时间明显延长，其中4种呈EGFR过表达，而其余7种放疗胶质瘤裸鼠模型的生存时间无明显延长，其中3种呈EGFR过表达状态，两者并无统计学意义[5]。本实验的结果表明，EGFR蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的阳性表达率无统计学意义(P>0.05)。细胞处于不同的细胞周期对放疗的敏感性不同。目前认为，细胞处于G1期对射线具有较高的敏感性，进入S期后对射线不敏感。Cyclin D1蛋白是细胞从G1期进入S期最重要的蛋白。Cyclin D1蛋白与CDK4/6形成活性复合物，Cyclin D1/CDK4/6参与G1期和S期的pRb磷酸化作用，使细胞进入S期。研究表明，Cyclin D1蛋白可抑制多种肿瘤的放疗敏感性。但是，在胶质瘤中尚未有定论。在本实验中，虽然Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的阳性表达率也呈上升趋势，但是无统计学意义(P=0.39)。EGFR蛋白和Cyclin D1蛋白都不能单独作为预测胶质瘤放疗敏感性的指标。

　　3.2 EGFR与Cyclin D1蛋白的联合检测

　　EGFR蛋白与Cyclin D1蛋白密切相关。EGFR蛋白可以通过激活MAPK通路和AKT通路激活Cyclin D1蛋白。王汉晋[6]采用Western blot检测乳腺癌中Cyclin D1蛋白的表达后发现对照组总灰度为17683nmols，加入EGF后总灰度增加了83%，两者具有统计学意义(P<0.05)。因此，作为EGFR的下游蛋白，Cyclin D1蛋白和EGFR蛋白联合检测可能能更好预测胶质瘤的放疗敏感性。在本实验中，EGFR蛋白和Cyclin D1蛋白在不同放疗敏感性胶质瘤中的阳性共表达率有统计学意义(P<0.05)，EGFR蛋白和Cyclin D1蛋白联合表达能预测胶质瘤的放疗敏感性。我们推测，EGFR激活Cyclin D1蛋白的各种通路，如MAPK通路、AKT通路等在抑制胶质瘤的放疗敏感性中起着重要的作用。深入研究EGFR、Cyclin D1蛋白及其相关通路抑制胶质瘤放疗敏感性的作用机制，将为胶质瘤的治疗提供新的途径。

　　【参考文献】

　　[1]吴承远，刘玉光. 临床神经外科学 [M]. 北京：人民卫生出版社, 2001:233248.

　　[2]Gerweck LE, Kornblith PL, Burlett P, et al. Radiation sensitivity of cultured human glioblastoma cells [J]. 1977, 125(1):231234.

　　[3]徐滨，宋来君，徐国本. 人脑星形细胞瘤组织转化生长因子α及表皮生长因子受体检测 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2005, 40(6):10841087.

　　[4]Weppler S, Li YN, Dubois L, et al. Expression of EGFR variant vIII promotes both radiation resistance and hypoxia tolerance [J]. Radiother and Oncol, 2007, 83(3):333339.

　　[5]Sarkari JN, Carlson BL. Use of an Orthotopic XenograftModel forAssessing the Effect of Epidermal Growth Factor ReceptorAmplification on Glioblastoma Radiation Response [J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(7):22642271.

　　[6]王汉晋，武正炎，卞建民. 表皮生长因子对ER阴性乳腺癌细胞株细胞周期的影响 [J]. 中华普通外科杂志, 2005, 20(1):4951.