去除白蛋白对脑脊液双向凝胶电泳结果的影响

　　作者：周乐1，和 平2，屈建强1，王一理3 作者单位：(1. 西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，陕西西安 710004;2. 西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科，陕西西安 710004;3. 生物医学信息工程教育部重点实验室/西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所，陕西西安 710061)

　　【摘要】 目的 探讨去除白蛋白对脑脊液双向凝胶电泳的影响。方法 应用HiTrapTM Blue分离柱，特异性去除脑脊液中的白蛋白，然后对去除白蛋白前后的脑脊液样本进行双向凝胶电泳研究，对比分析其结果。结果 未清除白蛋白脑脊液标本双向凝胶电泳可检出约200个蛋白点，而去除白蛋白后的脑脊液标本双向凝胶电泳仅检出约30余个蛋白点。大量其他蛋白信息伴随白蛋白同时丢失，剩余的蛋白信息很难全面反映脑脊液的蛋白质组学图谱。结论 去除白蛋白可能会造成其他相应蛋白分子的丢失，进而会影响到脑脊液双向凝胶电泳的研究结果。

　　【关键词】 脑脊液;白蛋白;双向凝胶电泳

　　Effects of albumen depletion on CSF twodimensional

　　gel electrophoresis researchZHOU Le1, HE Ping2, QU Jianqiang1, WANG Yili3

　　(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Respiratory Medicine,

　　the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;

　　3. the Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,

　　Institute for Cancer Research, School of Life Science & Technology,

　　Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)ABSTRACT:Objective To explore the effects of albumen depletion on cerebrospinal fluid (CSF) twodimensional gel electrophoresis (2DE) research. Methods Albumen was specially removed from CSF by HiTrapTM Blue. Then, CSF samples with and without albumen were compared by 2DE. Results About 200 spots in normal CSF and 30 spots in CSF without albumen were found by 2DE. Lots of proteins were lost in CSF after albumen depletion. It was difficult for the vestigial proteins 2DE map to present the protein composition of CSF. Conclusion Lots of proteins are lost when albumen is removed from CSF, which will affect CSF 2DE analysis results.

　　KEY WORDS: cerebrospinal fluid (CSF); albumen; twodimensional gel electrophoresis

　　中枢神经系统处于脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF )的包围之中。当中枢神经系统出现肿瘤性疾病时，脑脊液中往往出现相应蛋白表达变化[1]。蛋白质学技术的发展使从脑脊液中筛查有利于脑肿瘤早期诊断及病情监测的蛋白标志成为可能和必要[2]。然而，我们发现在很多脑脊液的相关蛋白质组学研究中结果不尽相同。既往研究表明，白蛋白在脑脊液中的比例超过50%，高丰度白蛋白的存在可能降低蛋白质组学研究中的双向凝胶电泳对低丰度蛋白的检出。于是众多学者采用首先特异性的去除白蛋白，然后对剩余脑脊液蛋白进行蛋白质组分析的方法进行研究。这一方法虽可能提高低丰度蛋白的检出，但是否会对研究结果造成其他影响呢?本研究应用目前较为常用的Amersham Biosciences(瑞典)公司生产的HiTrapTM Blue分离柱，特异性去除脑脊液中的白蛋白，然后对去除白蛋白前后的样本进行双向凝胶电泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)分析，比较白蛋白的去除对脑脊液2DE研究结果的影响，以期为日后的进一步研究提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 实验所用脑脊液来源于西安交通大学医学院第二附属医院神经外科住院患者。取样前告知患者取样目的并得到患者同意。

　　HiTrapTM Blue分离柱、固定pH梯度(IPG)胶条(PH310NL)、IPG缓冲液、银染试剂盒、图像分析软件Image Master 5.0均购自Amersham Biosciences公司;CHAPS、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、测序级的TPCK胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、αcyano4hydroxycinnamic acid(CHCA) 均购于Sigma公司。实验中所有用水均为milliQ水。

　　1.2 方法 脑脊液标本均分为两份，一份原液保存备用，另一份使用HiTrapTM Blue分离柱预分离脑脊液中的白蛋白。脑脊液中白蛋白的分离参照仪器说明，主要步骤如下：首先应用结合缓冲液充满并充分冲洗分离柱;将脑脊液与10×的结合缓冲液以9∶1的比例均匀混合，取1mL含有结合缓冲液的脑脊液样本以0.5mL/min速度缓慢通过分离柱;收集从分离柱去除白蛋白后所得的CSF样品备用;再用10mL结合缓冲液冲洗分离柱，满意后用10mL分离缓冲液冲洗分离柱，收集分离缓冲液洗脱的白蛋白样品备用。利用BioRad电泳系统对去除白蛋白前后的脑脊液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳。再分别取含80μg蛋白质的脑脊液样本，参照我们建立的实验方法[3]，丙酮浓缩干燥后行2DE电泳。最终应用Image Master 5.0软件行图像分析。

　　2 结 果

　　脑脊液经HiTrapTM Blue分离柱处理后，行SDSPAGE电泳，结果显示：在未去除白蛋白的脑脊液(图1第2道)和白蛋白洗脱液(图1第4道)中，大约66ku处均有大量蛋白存在，与人白蛋白69ku相近，说明HiTrapTM Blue分离柱很好地除去了脑脊液中的白蛋白。图1中第3道去除白蛋白的脑脊液与第2道相比少了白蛋白的对应条带。

　　将同一脑脊液去除白蛋白前后的样品浓缩后进行双向电泳(图2)，结果显示：未去除白蛋白的脑脊液标本双向凝胶电泳图谱中可见约200余个蛋白点，而去除白蛋白后的脑脊液标本双向凝胶电泳图谱中仅见约30余个蛋白点。可见有大量蛋白信息在去除白蛋白过程中丢失，而且所得的图谱信息含量很难进一步分析。以上实验重复3次结果相同。

　　3 讨 论

　　脑脊液由脉络丛和室管膜细胞产生，其成分与血清相近，中枢神经系统脑脊液共约90～150mL，而每天所产生的脑脊液是这一体积的数倍。病理状态下，因为血脑屏障损坏或鞘内异常合成，脑脊液的蛋白组成会发生变化，这种变化成为诊断和检测疾病的有利线索。研究表明，在软脑膜转移性肿瘤患者的脑脊液中，β葡萄糖醛酸酶、β2微球蛋白的浓度升高[45]。蛋白Tenascin是组成细胞外基质的一种糖蛋白，它与胶质瘤的侵袭性生长密切相关。在正常人群的脑脊液中，Tenascin的表达水平相对较低(<100ng/mL)，而在患有高级别星型胶质细胞瘤患者的脑脊液中，Tenascin的表达水平明显升高，可达300ng/mL以上。此外在伴有脑脊液播散转移的星形胶质细胞瘤患者中，Tenascin在脑脊液中的表达水平甚至可高达1000ng/mL[6]。以上结果足以说明，因为肿瘤的存在，患者脑脊液中的蛋白表达水平会发生相应变化。然而因为生命活动的复杂性，目前对脑脊液中单个蛋白水平变化的监测还不能做到对肿瘤等中枢神经系统疾病的早期准确诊断。因此近年来脑脊液的蛋白组学成为研究的热点，以利于寻找出中枢神经系统疾病(如胶质瘤、帕金森病、阿尔茨海默病等)早期诊断、治疗和长期疾病监测的蛋白标志物。

　　脑脊液中白蛋白的含量超过50%，免疫球蛋白含量也约为15%。双向电泳研究时，理论上总蛋白量相同情况下，高丰度蛋白浓度越高，其他低丰度蛋白的2DE检出率就会越低。然而，低丰度蛋白中往往含有众多与疾病密切相关的蛋白分子。为了更好地检出有意义的低丰度蛋白分子，通常通过特异性地去除CSF中的白蛋白，然后将低丰度蛋白浓集后进行相应后续研究。

　　近来不断有应用各种方法去除白蛋白并取得较好结果的报道，如李焕敏等[7]在去除脑脊液中高丰度蛋白之后，低丰度蛋白的检出率增加59.86%。这些研究极大地加深了人们对脑脊液和相关疾病间关系的理解。然而这种浓集方案是否是脑脊液蛋白质组学研究的最佳方案?

　　本实验中，从一向凝胶电泳结果来看(图1)，应用HiTrapTM Blue分离柱可以将白蛋白很好地清除，同时似乎对其他蛋白影响不大。在应用清除后的样本进行更加敏感的2DE时却发现，众多蛋白信息丢失，所余蛋白信息已很难全面表达脑脊液的蛋白质组学图谱。可见去除脑脊液中的白蛋白时，很有可能造成其他蛋白的同步丢失。

　　生理情况下，目前所知白蛋白在体内除承担维持胶体渗透压的作用外，主要承担运输载体作用。在清除白蛋白时有可能将大量被白蛋白转运的蛋白质一起清除，进而造成双向电泳研究时蛋白信息的大量丢失。所以，在进行脑脊液2DE研究时，为浓集低丰度蛋白而去除白蛋白时，必须考虑到有可能伴随其他蛋白信息的丢失。

　　本实验结果显示，目前情况下应用HiTrapTM Blue分离柱去除脑脊液中的白蛋白可能造成大量蛋白信息丢失，严重影响后续试验。因此，寻找更佳的白蛋白特异清除技术，以及应用窄pH值范围、更长长度IPG胶条增加2DE的分辨率，进而改善脑脊液的2DE研究是必要的。

　　【参考文献】

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　　[5]ANCKARSATER R, VASIC N, JIDEUS L, et al. Cerebrospinal fluid protein reactions during nonneurological surgery [J]. Acta Neurol Scand, 2007, 115(4):254259.

　　[6]YOSHIDA J, WAKABAYASHI T, OKAMOTO S, et al. Tenascin in cerebrospinal fluid is a useful biomarker for the diagnosis of brain tumor [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1994, 57(10):12121215.

　　[7]李焕敏，邵明，谭红愉，等. 脑脊液蛋白质组学高丰度蛋白去除方法的建立与评价 [J]. 现代临床医学生物工程学杂志, 2007, 13(2):9496.