胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞及其表达研究

作者：吕胜青,杨辉,张克斌

作者单位：（中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院1.神经外科；2.医学实验中心，重庆400037；3.中南大学湘雅医院神经外科，湖南长沙410008）

   【摘要】  目的探讨胞嘧啶脱氨酶（CD）自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。方法采用脂质体法将CD基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞，G418筛选阳性克隆（U251-CD），采用RT-PCR、免疫细胞化学染色、流式细胞仪（FCM）凋亡分析和高效液相色谱（HPLC）等方法检测CD基因的表达及其功能。结果CD基因成功转染U251细胞，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR证实阳性细胞有CD基因表达，抗-CD-抗体免疫细胞化学法显示细胞浆染色阳性，U251-CD细胞加入5-氟胞嘧啶（5-FC）后，FCM显示细胞凋亡峰，HPLC可检测到5-FC培养液内有5-氟尿嘧啶（5-FU）产生。结论CD基因能够在U251细胞表达，并具备将5-FC转变为5-FU的功能，造成肿瘤细胞凋亡，CD-5-FC系统可作为恶性脑胶质瘤辅助治疗手段之一。

【关键词】  胞嘧啶脱氨酶；转染；基因表达；神经胶质瘤

     CytosinedeaminasesuicidegenetransfectionanditsexpressiononU251malignantbraingliomacells

     LUShengqing1,YANGHui1,ZHANGKebin2,etal

     1.DepartmentofNeurosurgery;2.DepartmentofMedicalExperimentCenter,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,

     Chongqing400037,China

     Abstract:ObjectiveToexplorethemethodsofcytosinedeaminase(CD)suicidegenetransfectionanditsexpressioninU251malignantbraingliomacells.MethodsCDgenewastransfectedintoU251malignantbraingliomacellsusingliposome-mediatedmethod,positiveclone(U251-CD)wasscreenedwithG418presence.CDgeneexpressionanditsfunctionwereidentifiedbyRT-PCR,immunocytochemicalstaining,FCManalysisofapoptoticcellsandHPLC.ResultsCDgenewassuccessfullytransfectedintoU251cells,andpositiveclonewasscreenedoutafterG418presence.RT-PCRindicatedthatpositivecellscouldexpressCDgene,andimmunocytochemicalstainingwithCDantibodyshowedpositivereactioninthecellplasma.FCManalysisshowedapoptoticcellsaftergenetransfectionwith5-FCpresence.HPLCdetectionshowedthat5-FUwasdetectedinU251-CDcellmediumwith5-FCincubation.ConclusionCDgenecantransfectintoU251cells.U251-CDcellscanchange5-FCinto5-FU,andinducetumorcellapoptosis.TheCD-5-FCsuicidegenetherapysystemcanactasthemainassistantstrategyintreatmentofmalignantgliomas.

     Keywords:cytosinedeaminase;transfection;geneexpression;glioma胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase，CD）是在某些细菌和真菌内表达的酶类，真核细胞不含此酶，此酶能将5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）转变为5-氟尿嘧啶（5-fluorourial，5-FU）[1，2]。CD基因的成功克隆使其成为继HSV-tk基因之后的第二大类自杀基因。本研究以颅内最常见的脑胶质瘤为研究对象，探讨CD自杀基因转染U251恶性脑胶质瘤细胞的方法及其表达效果。

     1材料与方法

     1.1主要试剂与细胞系LipofectAmine2000脂质体（Invitrogen，美国），RT-PCR试剂盒（Takara，日本），绵羊抗-CD多克隆抗体（Biogenesis，英国），AnnexinVFITC凋亡试剂盒（晶美生物技术有限公司），细胞培养基DMEM与胎牛血清、G418、5-FC、5-FU（Sigma公司），pCMVCD质粒由日本YoshimuraI博士构建并惠赠，DNAMarker（北京天为时代生物技术公司）。U251恶性人脑多形性胶质母细胞瘤细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库。