LOX-1/NF-κB信号途径对ox-LDL刺激的人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响及氟伐他汀的干预作用
发表时间：2012-02-13 浏览次数：447次
作者：张小炼,张社兵,姜德谦 作者单位：湖南湘潭市中心医院心内科，湖南 湘潭
【摘要】目的：探讨血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)/核因子(NF)-κB信号途径对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症因子表达的影响及氟伐他汀的干预作用。方法：设立不同浓度的ox-LDL刺激组，LOX-1中和抗体干预组，NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氢基甲酸盐(PDTC)干预组，氟伐他汀干预组及空白对照组;检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-6的浓度。结果：25mg/L、50mg/L、100mg/L浓度的ox-LDL刺激组24h后上清液TNF-α浓度分别为：(32.34±2.46)pg/ml、(96.43±8.36)pg/ml、(62.79±4.64) pg/ml，IL-6浓度分别为：(264.71±15.06)pg/ml、(630.70±17.77)pg/ml、(378.62±16.33)pg/ml，均较空白对照组TNF-а(22.99±3.55)pg/ml、IL-6(80.37±8.29)pg/ml水平显著升高(P<0.05～0.01);NF-кB抑制剂PDTC和LOX-1中和抗体干预后上清液TNF-α浓度较50mg/L ox-LDL刺激组显著下降(P<0.01)。不同浓度氟伐他汀(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)干预HUVECs 24h后上清液TNF-α浓度分别为(73.84±6.50)pg/ml、(42.59±6.45)pg/ml、(23.55±4.27)pg/ml;IL-6浓度分别为(549.0±20.23)pg/ml、(434.56±22.4)pg/ml、(302.42±21.30)pg/ml，较50mg/L ox-LDL刺激组显著下降(P<0.05～0.01)。结论：氧化低密度脂蛋白可刺激人脐静脉内皮细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达，在25～50mg/L剂量范围内呈显著的剂量-效应关系。氟伐他汀可浓度依赖性抑制人脐静脉内皮细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达。
【关键词】 脂蛋白类,LDL,肿瘤坏死因子α;白细胞介素6;氟伐他汀
Abstract：Objective： To investigate effects of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor -1 (LOX-1)/NF (nuclear factor)-κB signals on expressions of inflammatory cytokines stimulated by ox-LDL (oxidized low density lipoprotein) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and intervention of fluvastatin. Methods：Ox-LDL stimulated group， LOX-1 neutralizing antibody intervention group， NF-κB inhibitor pyrolidine dithiocarbamate (PDTC) intervention group，fluvastatin intervention group and blank control group were established.The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in supernatant of all groups were measured. Results： Concentrations of TNF-a in supernatants after 24h stimulation by ox-LDL of 25mg/L， 50mg/L and 100mg/L were (32.34±2.46)pg/ml， (96.43±8.36)pg/ml and (62.79±4.64)pg/ml respectively， concentrations of IL-6 were (264.71±15.06)pg/ml， (630.70±17.77)pg/ml and (378.62±16.33)pg/ml respectively， and all these significantly increased compared with those of blank control group [TNF-α： (22.99±3.55)pg/ml， IL-6： (80.37±8.29)pg/ml]， P<0.05～0.01; after interventions of PDTC and LOX-1 neutralizing antibody， concentrations of TNF-a in supernatants significantly decreased compared with 50mg/L ox-LDL intervention group (P<0.01).Concentrations of TNF-a in supernatants after 24h intervention by fluvastatin of 0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L were (73.84±6.50)pg/ml， (42.59±6.45)pg/ml and (23.55±4.27)pg/ml respectively， concentrations of IL-6 were (549.0±20.23)pg/ml， (434.56±22.4)pg/ml and (302.42±21.30)pg/ml respectively， and all these significantly decreased compared with those of 50mg/L ox-LDL intervention group (P<0.05～0.01). Conclusion： Ox-LDL can stimulate expressions of TNF-a and IL-6 in supernatant of HUVECs and it shows significant dose-effect relationship in dose range of 25～50mg/L. Fluvastatin may dose-dependently inhibits expressions of TNF-a and IL-6 in supernatant of HUVECs.
Key words：Lipoproteins， LDL; Tumor necrosis factor-alpha;Interleukin-6; Fluvastatin
目前认为，动脉粥样硬化是一种多因素共同参与的慢性炎症性疾病。白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是介导炎症反应和免疫调节反应的重要促炎性细胞因子，具有广泛的生物学效应。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是促进动脉粥样斑块发生的主要脂质成分。新近发现的血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是内皮细胞膜上ox-LDL的特异性受体，它可作为信号分子传递生物信号，促进ox-LDL和细胞聚集于血管壁，加剧斑块的炎症反应和不稳定性[1]。核因子-κB(NF-κB)是一种重要的转录因子，活化的LOX-1可能通过诱导NF-κB活化，而调控TNF-a、IL-6等多种炎症介质的基因表达和细胞增殖，从而加剧动脉粥样硬化斑块局部的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发展[2]。众所周知，他汀类是当代动脉粥样硬化性疾病药物治疗的基础。它除能有效调脂外，还具有不依赖于胆固醇降低的非调脂性抗动脉粥样硬化作用。
本研究旨在证实ox-LDL能通过特异性受体LOX-1介导而促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上清液中细胞因子IL-6和TNF-a的表达，并观察氟伐他汀对其分泌的影响，初步探讨其可能的分子机制，从而为他汀类药物的调脂外抗炎症作用提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 主要材料与仪器
HUVECs(编号CRL-1730)，引自中南大学湘雅附一医院细胞库(来源于美国)。TNF-α和IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自深圳晶美生物有限公司，由酶联免疫检测仪 ELX800全自动酶标分析仪(BIO-EK Instrument INC)进行分析。
1.2 方法
1.2.1 实验设计和分组：用10%小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养基培养HUVECs，放置于37℃ 5% CO2培育箱中，稀释到1×106个/mm3，接种于6孔培养板中，次日待细胞贴壁后再无血清处理24h，以使细胞同步，即可进行实验干预。
(1)不同浓度的ox-LDL刺激组;以不同浓度的ox-LDL(25mg/L、50mg/L、100mg/L)刺激24 h;(2) LOX-1中和抗体干预组：预先以10μg/ml LOX-1中和抗体干预1 h，再加入50 mg/L ox-LDL刺激24 h;(3)NF-κB抑制剂PDTC干预组：预先以40μmol/L PDTC干预24 h，再加入50mg/L ox-LDL刺激24 h;(4)氟伐他汀干预组：预先予以不同浓度的氟伐他汀(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)干预24 h，再加入50mg/L ox-LDL刺激24 h。测定各组HUVECs上清液中炎症细胞因子IL-6，TNF-α的表达。
1.2.2 IL-6和TNF-α的检测： HUVECs培养上清液中IL-6和TNF-α的检测采用ELISA法。试剂盒购自深圳晶美生物制剂公司，最小可测人TNF-α为3pg/ml，IL-6为2pg/ml，所有标本均设复孔，严格按操作规程配制标准品。除空白孔外，依次将标本或不同浓度标准品，生物素化抗体工作液，酶结合物工作液(均100μl/孔)分别加入相应孔中;用封条封住，37℃孵育水平振荡700rmp/min×60min，弃去反应孔内液体，洗板3次。加入显色剂(100μl/孔);用封条封住反应孔，37℃避光显色15～25min(视显色深浅)。加入终止液(100μl/孔);混匀后即刻测量光密度(OD450)值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。主要试验数据来自3次以上重复试验，以均数±标准差(x-±s)表示，对主要指标进行正态性分布检验，符合正态分布的多组间样本比较采用单因素ANOVA检验，用LSD方法进行两两比较，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 ox-LDL对HUVECs细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响
HUVECs本身能分泌少量的TNF-α和IL-6，在25mg/L、50mg/L、100mg/L浓度的ox-LDL刺激HUVECs 24h后TNF-α和IL-6的分泌量均有增加，其中25～50mg/L浓度的ox-LDL刺激后TNF-α和IL-6的分泌量呈浓度依赖性增加，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)，用100mg/L浓度的ox-LDL刺激后，TNF-α和IL-6的分泌量有下降趋势，但仍较空白对照组增高。见表1及图1、2。图1 氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上清液肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的影响表1、2，图2～4同。
2.2 NF-κB抑制剂PDTC和LOX-1抗体干预对HUVECs TNF-α和IL-6分泌的影响
预先以NF-кB抑制剂PDTC或LOX-1中和抗体干预后，再以ox-LDL 50mg/L刺激，HUVECs上清液中TNF-α和IL-6分泌量均较ox-LDL 50mg/L刺激组显著下降(P<0.01)，但显著高于空白对照组(P<0.05)，两者变化趋势相一致，比较无显著差异，见图3、4，表2。图2 ox-LDL刺激对HUVECs上清液白细胞介素(IL)-6表达的影响表1 ox-LDL对HUVECs 细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响表2 PDTC和LOX-1中和抗体干预对HUVECs TNF-α和IL-6分泌的影响表3 氟伐他汀干预对HUVECsTNF-α和IL-6分泌的影响图3 LOX-1抗体和PDTC干预对HUVECs上清液TNF-α表达的影响图4 LOX-1抗体和PDTC干预对HUVECs上清液IL-6表达的影响
2.3 氟伐他汀干预对HUVECs TNF-α和IL-6分泌的影响
预先以不同浓度氟伐他汀(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)干预HUVECs 24h后，再以50 mg/L ox-LDL刺激HUVECs，则上清液中TNF-α，IL-6浓度呈浓度依赖性降低，与ox-LDL 50mg/L刺激组比较有显著差异(P<0.01)。见表3及图5、6。图5 氟伐他汀干预对HUVECs上清液TNF-α表达的影响图6 氟伐他汀干预对HUVECs上清液IL-6表达的影响
3 讨 论
动脉粥样硬化被认为是一种炎性疾病。ox-LDL在动脉粥样硬化及与之相关的炎症反应中发挥重要的作用。它可刺激促炎症信号的表达，如TNF-a和IL-6等细胞因子的分泌[3,4]，此外，ox-LDL致动脉粥样硬化程度不仅决定于其自身水平，还取决于其受体及受体后效应的变化。LOX-1是ox-LDL的特异性受体，在人和动物粥样斑块中均发现有LOX-1的表达[5,6]。它与其他ox-LDL受体没有任何结构上的同源性[7]。LOX-1可介导ox-LDL上调LOX-1的表达，起到自身调节作用[8] ，能特异性结合﹑摄取及降解ox-LDL并介导其生物学功能。
NF-κB是一种能调节多种炎症和免疫基因表达的重要转录因子。在人类动脉粥样斑块损伤中的内皮细胞、单核/巨噬细胞和平滑肌细胞中均证实有活化的NF-κB存在[9-11]。NF-κB的异常激活不仅是动脉粥样硬化发生的始动机制之一，而且是机体炎症反应放大与持续的分子生物学机制，在本研究中，我们用ox-LDL(25、50、100mg/L)与HUVECs共培养，发现炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达上调，在25～50mg/L剂量范围内呈显著的剂量-效应关系(P<0.01)。但在较高浓度ox-LDL(100mg/L)作用下，TNF-α和IL-6的表达有所下降，这可能与高剂量的ox-LDL存在细胞毒性作用，使细胞形态结构发生损伤，从而导致细胞死亡率增加有关。分别用LOX-1中和抗体和NF-κB抑制剂PDTC干预后均可下调上述指标的表达，表明ox-LDL可通过活化LOX-1/NF-κB信号途径，引发细胞因子TNF-α和IL-6的表达增高。因此，我们推测LOX-1不仅是ox-LDL的特异性受体，同时也可能作为信号分子传递生物信息，调节生物转录与合成，从而触发和加剧动脉粥样硬化。
他汀类药物是目前已知降低胆固醇最有效的药物，在冠心病防治上具有里程碑意义。近年研究发现他汀类药物还具有抗血栓形成，保护血管内皮细胞，抗氧化及抗炎等多效性作用，但其抗炎机制尚未十分清楚。大量临床研究发现，他汀类药物在改善患者血脂水平的同时，可显著减少临床心血管事件的发生，从而推测，他汀类药物可能通过降低血循环中的ox-LDL水平，减少脂质在斑块中沉积，从而产生继发性抗炎效应，因此认为他汀类药物的抗炎作用与其降脂作用有关。然而，也有研究表明血脂水平处于或低于平均水平而C反应蛋白水平高的患者，他汀类药物治疗仍能获得相当的益处，这提示他汀类药物具有独立于降脂作用以外的抗炎特性。最近Weitz-Schidt等也报道他汀类药物的抗炎作用并不依赖胆固醇水平的降低，而具有直接抗炎作用[12,13]。本研究结果表明，氟伐他汀呈浓度依赖性抑制ox-LDL刺激下的内皮炎症细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平，减弱内皮炎症反应，从而抑制动脉粥样硬化的进程。
综上所述，本研究证实ox-LDL是通过与新近发现的内皮细胞膜受体LOX-1特异性结合，使其活化并自身调节，进一步诱导NF-κB的活化，从而促进炎症因子TNF-α和IL-6的释放。氟伐他汀能下调ox-LDL诱导的内皮炎症反应，从而为他汀类药物的非调脂抗动脉粥样硬化机制提供新的理论依据。
【参考文献】
[1]Hayashida K，Kume N，Minami M，et al.Lectin-like oxidized LDL receptor-1(LOX-1) supports adhesion of mononuclear leukocytes and a monocyte-like cell line THP-1 cells under static and flow conditions[J].FEBS Lett,2002,511(1)：133-138.
[2]Barnes PJ，Karin M.Nuclear foctor-κB：a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases[J].New Engl J Med,1997,336(15)：1066- 1071.
[3] Cesari M，Penninx BWJH，Newman AB，et al.Inflammatory markers and onset of cardiovascular events：results from the health ABC study[J]. Circulation,2003,108：2317-2322.
[4]刘 丁，赵 丽.急性心肌梗死患者肿瘤坏死因子的动态变化[J].中华内科杂志，2000,39(7)：499.
[5]Chen M，Kakutani M，Minami M，et al.Increased expression of lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor-1 in initial atherosclerotic lesions of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(4)：1107-1115.
[6] Kataoka H，Kume N，Miyamoto S，et al.Expression of lectinlike oxidized low-density lipoprotein receptor-1 in human atherosclerotic lesions[J].Circulation,1999,99(24)：3110-3117.
[7]林秋雄，余细勇，单志新，等.Ox-LDL诱导巨噬细胞TNF-α的时序表达[J].中国病理生理杂志，2003,19(11)：1552-1553.
[8]薛 莉，单 江，陈乃云，等.氧化型低密度脂蛋白诱导LOX-1在基因和蛋白水平表达[J].科技通报，2004,20(6)：552–559.
[9]Brand K，Page S，Rogler G，et al.Activated transcription factor nuclear factor-kappaB is present in the atherosclerotic lesion[J].J Clin Invest,1996,97(7)：1715-1722.
[10]Wilson SH，Best PJ，Edwards WD，et al.Nuclear foctor-κB immunoreactivity is present in human coronary plaque and enhanced in patients with unstable angina pectoris[J].Atherosclerosis,2002,160(1)：147-153.
[11]熊 盈，陈思娇，高 阳，等.糖尿病大鼠动脉粥样硬化核转录因子-κB活化作用的研究[J].心血管康复医学杂志，2008,17(1)：12-15.
[12]Weitz-Schmidt G.Statins as anti-inflammatory agents[J].Trends Pharmacol,2002,23(10)：482-487.
[13]Weitz-Schmidt G，Welzenbach K，Brinkmann T，et al.Statins selectively inhibit leukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrin site[J].Nat Med,2001,7：687-692.
