高表达钙蛋白酶小亚基1诱导肝细胞癌上皮间质转化研究

肝癌患者的预后差,手术切除被认为是根治肝癌的最好手段,但术后容易发生复发转移,然而对于肝癌复发转移目前治疗手段有限上~.我们前期的研究表明:钙蛋白酶小亚基I(Capn4)的表达随肝癌细胞侵袭转移潜能密切相关2厂但其具体机制尚不清楚,本研究旨在探讨Capn4促进肝癌侵袭与转移的机制.    一、材料与方法    1.材料:HCCLM6由复旦大学附属中山医院肝癌研究所樊嘉教授惠赠;pGMLV-shRNA-Capn4和pGMI,.V-cDV}-Capn4由卜海吉满生物科技有限公司合成.    2.细胞培养及慢病毒感染:HCCLVI6,Hep3B细胞在含10%胎牛Il1L清DMEVI与MEA-T培养基中培养,感染方法按照义献.、48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)与红色荧光蛋白(RFP)表达判断转染效率.    3逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测:细胞总R\A提取参照Trizol试剂盒说明书进行操作;Capn4、波动蛋自(Vimentin),E一钙薪蛋白(E-cadherin)及甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由[海申能博彩生物有限公司合成;逆转录参照试剂盒说明书进行.    4.esternblot分析与免疫组织化学:免疫组织化学检测采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(SP)法,胞膜见棕褐色颗粒为E-cadherin表达阳性细胞,而细胞质见棕褐色颗粒为Capn4与Vimentin表达阳性细胞.    5.免疫荧光检测:培养至细胞状态良好时进行免疫荧光染色,荧光显微镜200倍视野下观察.    二、结果    1.慢病毒感染建立不同Capn4表达的肝癌细胞株:慢病毒转染48h后的荧光照片显示转染满意,转染后的细胞分别命名为HCCLM6-vshCapn4}Hep3B-Capn4一.D\}-RT-PCR、western检测显示下调和上调Capn4结果满意.    2.Transvcell实验检测细胞的运动侵袭能力:通过计数各组穿过人工基底膜的细胞数并进行比较后,发现Capn4下调后,月和翻细胞穿过人工基底膜的细胞数明h;咸少:而在}=i}]Ca}}n-t表达的Hep3B细胞,其浸袭与转移能力明显升高.    3调节Cepn=1表达后细胞形态、上皮与间皮标记改变:与HCCLM6-vshCapn4及Hep3B-Vlock比较,较多HCCLM6-Mock与Hep3B-cD1tA-Capn4细胞呈梭形,而RT-PCR与}Uester1Mcat检则的结果表明扦嘻HCCI.\l6一、shCapn-1与He}a}B-)lock细胞中,E-cadh.川r表达较HCCL}16-Mock与Hep3B-cD1}-Capn}l高,而}imentin却呈相反趋势,免疫荧光结果也支持以上结果.    4.免疫组织化学检测肝癌组织中Cape与E-cadherin蛋白的表达:Capri4蛋白阳性染色主要定位于癌细胞胞质,呈棕黄色或棕褐色,染色均一E一二dher工Il定位于细胞膜在}.t31)n}高表达的肝癌组织,可见到绝大部分E-cadherin表达明显卜调,而}imentin表达上调几份.    讨论    Calpain是由大小2个亚基共同构成,28000的Capn4是其调节性小亚基,与80000的大亚基以异二构体的形式存在Calpain是1个胞质富集的蛋自酶,能清除很多细胞内信号和结构蛋白,涉及广泛的细胞功能,包括:细胞侵袭运动、增殖、凋亡等近年来,Calpain与肿瘤的关系口益受到重视.    我们的前期研究提示Capn4蛋白在人肝癌细胞浸袭转移中有着重要的作用5一恶性肿瘤细胞侵袭和转移的基础.首先是肿瘤细胞摆脱细胞间的赫附作用即失去接触性抑制E-cadherin是1种跨膜糖蛋白,由723一748个氨基酸组成,广泛分布于上皮细胞中,表达下降时细胞间赫附作用减弱,肿瘤细胞易于脱离原发灶6」本研究结果显示,邻近癌灶的正常肝细胞膜表面强烈均质表达E-cadherin,而其在肝癌细胞膜上染色多不均匀,偶见细胞质中模糊、弥散染色,且E-cadherin在肝癌组织中的阳性率远低于正常肝组织有研究结果显示,肝癌组织中E-cadherin的表达,除明显弱于正常肝组织外,还与多种临床病理因素相关如门脉癌栓,肝癌细胞低分化等,提示E-cadherin表达减弱与肝癌细胞的低分化趋向、浸润性密切相关[7]进而,本研究结果显idsE-cadherin与Capn4表达呈负相关,而和Vimentin呈相同趋势提示高表达Capn4可能下调E-cadherin的表达,Capn4的这一作用可能与其参与1秀导肝细胞癌L皮间质转化相关.    参考文献    汤钊猷. 原发性肝癌的研究进展[J].中国肿瘤临床,1998.137-142.    Bai DS,Dai Z,Zhou J. Capn4 overexpression underlies tumor invasion and metastasis after liver transplantation for hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009,(2):461-475.doi:10.1002/hep.22638.    Shi GM,Ke AW,Zhou J. CD151 modulates expression of matrix metalloproteinase 9 and promotes neoangiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2009.183-196.    Storr S J,Carragher NO,Frame MC. The calpain system and cancer[J].Nature Reviews Cancer,2011.365-374.    柏斗胜,樊嘉,代智. 肝癌肝移植相关定量蛋白质组学研究[J].中华实验外科杂志,2007,(12):1517-1519.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.024.    Giannelli G. The epithelial-mesenchymal transition:fact or fiction in cancer[J].Hepatology,2009.1344-1346.    van Zijl F,Zulehner G,Petz M. Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J].FUTURE ONCOLOGY,2009.1169-1179.