动态浊度法检测注射用头孢替唑钠的细菌内毒素含量

头孢替唑钠为半合成的头孢菌素衍生物，其作用机理是通过抑制细菌细胞壁的合成而发挥抗菌活性。头孢替唑钠对下列细菌有抗菌活性：①需氧革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌。②需氧革兰氏阴性菌：大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌。在临床上主要用于败血症、肺炎、支气管炎、支气管扩张症(感染时)、慢性呼吸系统疾病的继发性感染、肺脓肿、腹膜炎、肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎的治疗。本文采用动态浊度法对其细菌内毒素进行定量研究。动态浊度法(kinetic turbidimetriclimulustest)是浊度法定量测定的一种，其原理系微量的内毒素与鲎试剂中的C因子发生反应，激活凝固酶原、切断凝固蛋白原特定位置的精氨酸肽键，形成凝固蛋白从而产生凝胶过程中的浊度变化，采用适当的光学仪器测量的一种分析方法。本实验系根据测定到达事先设定反应液的浊度变化值所需的时间(t)的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系以定量检测细菌内毒素。1　材料与仪器细菌内毒素检查用水(批号091019，规格每支5mL，湛江安度斯生物有限公司);动态浊度法鲎试剂(批号091230，λ=0.005EU?mL-1，每支1.25mL，湛江安度斯生物有限公司);细菌内毒素国家参考标准品(批号150601-201070，规格每支140EU，中国药品生物制品检定所);注射用头孢替唑钠(批号090620,090315,090820,090528，规格0.25g/支，海南卫康制药有限公司)，BET—72型细菌内毒素测定仪(天津市天大天发科技有限公司)。2　方法与结果2.1　实验条件检测温度：37℃;检测波长：450nm;最长检测时间：3600S;浊度变化值OD设定为0.02。2.2　细菌内毒素限值(L)的确定：按公式L=K.M-1，K为最小致热阈值(5.0EU.kg-1)，M为家兔给药剂量(60mg.kg-1)。计算得注射用头孢替唑钠得内毒素阈值为0.083EU.mg-1。2.3　标准曲线制备及可靠性用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素国家参考标准品进行溶解稀释，使其最终内毒素浓度为8.0,2.0,0.5,0.125,0.0313EU?mL稀释系列，各取0.2mL分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入浊度仪进行检测，每一浓度平行4管，同时做阴性对照，结果见表1回归方程：lgT=2.9663+(-0.274LgC)r=-0.9984最低浓度=0.0313EU/ml，且空白对照管在检测时间外，故标准曲线成立。表1　标准曲线的可靠性2.4　供试品溶液配制及干扰试验2.4.1　供试品最大有效稀释倍数(MVD)或最低有效浓度(MVC)计算注射用头孢替唑钠的规格为0.25g/支，按公式MVC=λ/L其中λ为标准曲线的最低浓度0.03EU/ml，L为注射用头孢替唑钠内毒素限值0.083EU.mg-1，计算的MVC为0.36mg.ml-1，注射用头孢替唑钠的规格为0.25g/支，计算MVD为694倍。2.4.2　干扰预试验：本实验仅对其一定范围进行系列稀释，以筛选最佳检查浓度。将注射用头孢替唑钠用细菌内毒素检查用水溶解稀释为20,40,80倍溶液，每个浓度分别取0.20mL供试品加0.10mL鲎试剂作为样品检查，每个浓度平行做2管，同时另取8管，进行同样倍数稀释，并在稀释液中添加λ为0.5EU/ml得内毒素标准溶液，作为样品阳性对照管，同时取各液0.2ml加入鲎试剂0.10ml，混匀后插入细菌内毒素测定仪内进行检测，计算平均回收率，结果见表2。表2　注射用头孢替唑钠的干扰预实验稀释倍数,回收率2.4.3　干扰试验：取4批家兔热原检查合格的注射用头孢替唑钠，分别用细菌内毒素检查用水制成复溶液40倍稀释液(浓度0.025g?mL-1)作供试品溶液，同时另取4管稀释成同样浓度，并在稀释液中添加中点浓度为(0.5EU.ml-1)的内毒素作为样品阳性对照液，分别取上述各液0.20mL加入预先加有0.10mL鲎试剂的反应管内进行检测，每个浓度点重复2管，并设空白对照，计算平均回收率。结果见表3计算用回归方程LgT=2.99892+(-0.273LgC)r=-0.9987结果表明：4批注射用头孢替唑钠干扰试验添加内毒素回收率均在有效范围50%-200%内，表明无干扰影响，常规监控时用复溶液20倍稀释(浓度0.0125?mL)进行检测即可。表3　注射用头孢替唑钠干扰试验结果3　讨论3.1　干扰试验结果表明，注射用头孢替唑钠在40倍稀释(浓度0.025g?mL)时，已不存在干扰作用。3.2　动态浊度法进行细菌内毒素定量检测，使用计算机全过程监控，样品反应情况能在显示屏上直观地反应出来，与传统的热原家兔法和凝胶法相比，避免了动物个体差异及人为判断误差所造成的假阳性或假阴性结果，具有灵敏、简便、结果准确等优点，其检测结果与家兔热原检查结果一致，因此，用动态浊度法检测注射用头孢替唑钠中细菌内毒素含量是可行的。【参考文献】[1]　黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997,32(2)：72.[2]　中国药典[S].2005.二部：附录XIE.