纤维素酶的稳定性研究

随着工业文明的飞速发展，能源瓶颈逐步凸显，能源短缺将是本世纪人类面临的重大课题之一[1]，开发优质清洁的能源已迫在眉睫。目前纤维素酶已被广泛的应用在多个领域中，而且利用纤维素生产燃料乙醇技术由于其良好的环境效益和经济效益已越来越受到世界各地的重视，并逐渐发展起来。纤维素是地球上最丰富的有机物之一，是一种可再生的能源。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，进一步发酵产生乙醇等能源物质，可以变废为宝缓解世界性能源危机。纤维素酶和半纤维素酶特异性高，使之在再生能源利用方面具有很广阔的前景[2]。纤维素酶的稳定性较差，因此提高纤维素酶的稳定性是这个领域的热点问题。1.1　酶固定化[3]由于酶的化学本质是蛋白质，起催化作用除了决定于酶本身的结构与性质外，外界条件也有重要的影响，这些因素主要有温度、pH、底物浓度、酶浓度、产物浓度、激活剂、抑制剂等。条件不适应时酶极易变性，从而降低或失去活性。对酶进行固定化处理后，一般稳定性有较大的提高，对抑制剂的敏感性降低，而且有的酶具有了抗蛋白酶分解的特性。1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象后，科学家就开始了固定化酶的研究工作。我国的固定化酶研究开始于1970年。酶的固定化是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋，从而提高酶的相对稳定性。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：　① 极易将固定化酶与底物、产物分开;②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应;③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性;④酶反应过程能够加以严格控制;⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺;⑥较游离酶更适合于多酶反应;⑦可以增加产物的收率，提高产物的质量;⑧酶的使用效率提高，成本降低。酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，见表1-1表1-1　酶的固定化方法稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题，在大多数情况下酶经过固定化后稳定性都有所增加，这是十分有利的。Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性于固定化前的进行比较，发现其中有30种酶经固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8酶稳定性降低。由于尚未找到固定化方法与稳定性的规律，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。1.2　温度对酶作用的影响[4]酶促反应同大多数化学反应一样，受温度影响较大。温度每升高10℃所增加反应速度成为反应系数(temperature coefficient，一般用Q10表示)。一般化学反应为Q102～3(提高2～3倍)，但酶促反应的Q10仅为1～2(提高1～2倍)。在一定范围内，反应温度达到最大时的温度称为酶的最适温度(optimum temperature)，各种酶的最适温度是不同的，就整个生物界而言，动物组织的各种酶的最适温度一般在35℃～40℃，植物和微生物的各种酶的最适温度范围较大，大约在32℃～60℃之间，少数酶的最适温度在60℃以上。温度对酶促反应速度的影响有两个方面：一方面是在一定范围内当温度升高时，反应速度就加快;另一方面，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，超过一定范围，反应速度反而降低。这是由于酶蛋白变性之故，各种酶的变性温度不一，大多数在60℃以上变性，少数酶可耐受较高的温度。而固定化纤维素酶和固定化溶菌酶的最适反应温度为60℃。只是因为低于80℃时，酶分子没有和底物充分接触，即反应不完全，高于80℃后载体上部分酶分子由于本质上的对热敏感而失活，总体上固定化纤维素酶的最适温度为80℃。1.3　pH对酶作用的影响[4]大多数酶的活性受pH的影响较大。在一定pH下酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力均降低。酶表现最大活力时的pH值称酶的最适pH(optimum pH)。pH对酶促反应的影响，主要有下列原因：①影响酶和底物的解离。②影响酶分子的构象，过高过低的pH会改变酶的活性中心构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。各种酶在一定条件下都有一定的最适pH值。一般说来大多数酶的最适pH值在5～8之间，植物和微生物的最适pH值多为4.5～6.5左右，动物体内的酶其最适pH值为6.5～8左右。1.4　酶浓度对酶作用的影响[4]在酶催化的反应中，酶先要与底物形成中间复合物，当底物浓度大大超过酶浓度时，反应速度随酶浓度的增加而增加(当温度和pH不变时)，两者呈正比例关系。1.5　糖对酶保护作用添加保护剂的方法是最简便易行的酶稳定化方法[5]。其中海藻糖、葡萄糖、蔗糖和葡聚糖对纤维素酶热稳定性影响的实验已经证实[6]，在室温和高温下海藻糖对纤维素酶都有很明显的保护作用，在室温下葡萄糖和蔗糖对纤维素酶有保护作用，但在高温下会加速酶的失活。在室温下葡聚糖对纤维素酶没有保护作用，但在高温下对酶有明显的保护作用[7]。1.6　研究展望纤维素酶活力高但稳定性差，一直以来这都是纤维素酶在工业生产中应用的一大技术难题[8]。因此提高纤维素酶的稳定性已是刻不容缓。目前研究领域中提高酶稳定性的方法很多，例如对酶进行化学修饰，可以将纤维素酶固定化、添加最佳保护剂和在最优化的条件下保藏，以提高其稳定性。这将为纤维素酶酶解纤维素生产燃料乙醇工业提供新的技术支持，是原材料得到充分利用以提高生产效率，将会大大改变能源短缺的局面。【参考文献】[1]　Campbell BA，Laherrere JH.The end of cheap oil[J].Sci.Am,1998,3(1)：78.[2]　段钢，孙长平.酶在生化物质转化为燃料酒精中的应用[J].食品与发酵工业，2005,31(5)：76.[3]　罗贵民，牟莹，曹淑桂.酶工程[M].化学工业出版社，2003：57～68.[4]　张洪渊，刘克武.生物化学[M].四川大学出版社.2002：176～178.[5]　罗贵民.酶稳定化研究[J].生物化学与生物物理进展，1992,19(2)：107～113.[6]　杨小民，杨基础.几种糖对纤维素酶热稳定性影响的研究[J].清华大学学报，2000,40(2)：51～54.[7]　杨小民，杨基础.不同糖对纤维素酶保护的研究[J].清华大学学报，2000,40(2)：55～58.[8]　Ciarǎn O Fagain.Enzyme stabilization-recent experimental progress[J].Enzyme and microbial Technology,2003,33：13.