HPLC法测定复方茶碱麻黄碱片中四种组分的含量

1　仪器与试药1.1　仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，塞多利斯BP-211D电子天平。1.2　试药茶碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100121-199903);咖啡因对照品(中国药品生物制品检定所，批号：171215-200305);可可碱(厂家提供精制原料，按国家标准标定含量为99.70%);盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：714-9202);复方茶碱麻黄碱片样品(某厂家提供)，甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、三乙胺等为分析纯，水为纯化水。2　方法与结果2.1　色谱条件色谱柱：Dismonsil(Dikma)C18(20cm*4.6mm,5μl);以0.05mol/L磷酸二氢钾-甲醇-三乙胺(77：23：0.02)为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃。2.2　试验液的制备2.2.1　对照品溶液的制备精密称取可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱、咖啡因对照品适量，加0.1mol/L盐酸溶解并稀释制成每1ml含可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱、咖啡因分别为25μg、25μg、10μg、15μg的溶液，作为对照品溶液。2.2.2　供试品溶液的制备取厂家提供样品适量，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于茶碱12.5mg)，置200ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量，超声溶解，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。2.2.3　阴性空白溶液取处方项下除可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱、咖啡因以外其他辅料的处方量，照“2.2.2”项下方法制备，即得。2.3　专属性试验分别取“2.2” 项下三种溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果空白试验无干扰，色谱图见图1、图2。图1　供试品溶液图2　阴性空白溶液2.4　检测限取1.0ml可可碱的浓度为2.532μg/ml、盐酸麻黄碱的浓度为1.091μg/ml、茶碱的浓度2.468μg/ml、咖啡因的浓度为 1.550μg/ml的对照品溶液，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，进样20μl，记录色谱图，盐酸麻黄碱的主峰高约为噪音的3倍。经计算，以盐酸麻黄碱计，检测限为10.91ng/ml。2.5　定量限取5.0ml可可碱的浓度为2.532μg/ml、盐酸麻黄碱的浓度为1.091μg/ml、茶碱的浓度2.468μg/ml、咖啡因的浓度为 1.550μg/ml的对照品溶液，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，进样20μl，记录色谱图，盐酸麻黄碱的主峰高约为噪音的10倍。经计算，以盐酸麻黄碱计，检出限为54.55ng/ml。2.6　线性试验考察分别精密称取可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱、咖啡因对照品26.96mg、24.47 mg、10.62 mg、14.90 mg置于200ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1ml、2ml、5ml、7.5ml、10ml，分别置5个不同的25ml量瓶中，加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。取各溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱、咖啡因的回归方程分别为：A=78.963C+15.992，r=1.0000、A=71.758C+11.578，r=1.0000、A=21.686C-0.3131，r=1.0000、A=89.385C+3.6424，r=1.0000;线性范围分别为5.392 μg/ml～53.92 μg/ml、2.124 μg/ml～48.94 μg/ml、4.894 μg/ml～21.24 μg/ml、2.98 μg/ml～29.8 μg/ml。2.7　精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，在上述色谱条件下测定，连续进样5次，分别测定峰面积，可可碱、盐酸麻黄碱、茶碱、咖啡因的面积RSD(n=5)分别为0.2%、0.1%、0.4%、0.2%。2.8　稳定性试验将同一供试品溶液于室温下放置20小时，分别于0、1、7 、14 、20小时，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别测定峰面积，可可碱、盐酸麻黄碱、茶碱、咖啡因的峰面积RSD分别为0.4%、0.5%、0.3%、0.4%，结果表明：供试品溶液中四种成分在20小时内稳定。2.9　回收率试验称取处方量辅料9份(80%、100%、120%)，分别置200ml量瓶中，分别精密加入可可碱、茶碱、盐酸麻黄碱及咖啡因对照品适量(80%、100%、120%)，照“2.2”项下的方法制备供试品溶液和对照品溶液，进行回收试验测定，计算回收率。可可碱、盐酸麻黄碱、茶碱、咖啡因的平均回收率分别为100.1%(RSD=0.5%),100.5%(RSD=1.0%),00.2%(RSD=0.6%),100.7%(RSD=0.7%)。2.10　样品的测定 取三批样品，依法测定含量，结果见表1。表1　三批样品含量测定结果3　讨论3.1　流动相的选择参照[国家药品监督管理局《国家药品标准》WS-10001-(HD-1097)-2002(化学药品地方标准上升国家标准第十一册)]复方妥英麻黄茶碱片标准中含量测定所用的流动相，经过摸索，选择以0.05mol/L磷酸二氢钾-甲醇-三乙胺(77：23：0.02)为流动相。用两支C18柱测定，均可将茶碱、咖啡因、可可碱、盐酸麻黄碱很好的分离。色谱柱信息及各组分理论板数结果见表2。表2　色谱柱信息及各组分理论板数3.2　检测波长的确定精密称取茶碱对照品11.23mg，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并制成11.23μg/ml的溶液，在200nm-300nm波长范围内进行紫外扫描，结果最大吸收波长为203nm;精密称取可可碱对照品12.10mg，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并制成12.10μg/ml的溶液，在200nm-300nm波长范围内进行紫外扫描，结果最大吸收波长为204nm;精密称取咖啡因对照品8.03mg，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并制成8.03μg/ml的溶液，在200nm-300nm波长范围内进行紫外扫描，结果最大吸收波长为206nm;精密称取盐酸麻黄碱对照品5.34mg，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解并制成5.34μg/ml的溶液，在200nm-300nm波长范围内进行紫外扫描，结果最大吸收波长为206nm。综上，四种成分的最大吸收波长均在210nm以下，但一般检测波长应在210nm以上，故选择215nm为测定波长【参考文献】[1]　《中国药典》第一部、第二部(2010年版)[S].[2]　[国家药品监督管理局《国家药品标准》WS-10001-(HD-1097)-2002(化学药品地方标准上升国家标准第十一册)]复方妥英麻黄茶碱片质量标准[S].[3]　[国家药品监督管理局《国家药品标准》WS-10001-(HD-0512)-2002(化学药品地方标准上升国家标准第六册)]可可碱质量标准[S].