木瓜超氧化物歧化酶粗提物颗粒的加工及生物学效应研究

作者                                                      作者单位

赵靖               第三军医大学预防医学院营养与食品卫生教研室,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆400038

糜漫天             第三军医大学预防医学院营养与食品卫生教研室,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆400038

唐勇               第三军医大学预防医学院营养与食品卫生教研室,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆400038

张婷               第三军医大学预防医学院营养与食品卫生教研室,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆400038

王建               第三军医大学预防医学院营养与食品卫生教研室,重庆市营养与食品安全重点实验室,重庆400038

人体细胞内活性氧与人的衰老有密切的关系。酶类的化妆品主要以添加超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)为主。国际上最近以大蒜、韭菜、玉米淀粉等为原料提取纯化SOD,在动物实验中取得了与动物来源的SOD相同的营养功效[1]。

木瓜(Chaenomeles chinensis)果实含有丰富的营养物质和活性成分。国内外有少量关于木瓜中多酚类物质和抗氧化能力的报道[2],而木瓜SOD的相关研究甚少。通过本实验室前期初步研究,发现木瓜提取物中不但含有很高的黄酮类物质、酚类物质,还含有较高的SOD[3]。

随着微胶囊技术的发展,其在食品工业中的应用越来越广泛,特别在保护多肽、蛋白质、酶类等活性物质的生物活性、提高稳定性、延长半衰期、延缓释放方面起到巨大的作用。以木瓜为原料开发植物SOD复合保健品,运用食品微胶囊技术保持产品生物活性、提高口服性,可以为木瓜产品的开发开辟一条新的途径[4]。本研究对木瓜SOD粗提物颗粒进行加工并评价其生物学效应。

1　材料与方法

1. 1　试验材料

木瓜(Chaenomeles chinensis)购自綦江县打通镇木瓜基地;纤维素-果胶复合酶、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒:南京建成生物工程研究所;丙二醛(MDA)试剂盒:南京建成生物工程研究所;三蒸水(实验室自制);γ-环糊精、β-环糊精、卵磷脂等

试剂均为分析纯;实验动物:昆明种小白鼠,为BALB/C纯系小鼠,雄性, 8~10周龄,体质量18~20 g,由第三军医大学实验动物中心提供,置于标准动物房喂养,喂养基础饲料,自由进食和饮水。

1. 2　主要仪器与设备

超微粉碎设备:甘肃天水解放军6913超微细设备厂;电子分析天平;磁力搅拌器;数显恒温水浴锅; pH-3C酸度计;日立SCR20BC高速冷冻离心机: SIGMA aborzentrifugen ZK15; viva-Flow50超滤膜组件:USA;电脑核酸蛋白检测仪ODELHD-4:上海青浦沪西仪器厂;喷雾造粒机:重庆英格尔医药设备制造厂。

1. 3　实验方法

1. 3. 1　SOD粗提物的加工工艺研究

木瓜洗净、去核、切成小块。称取100 g加入200 ml去离子水打浆,得匀浆,向其中加入1%纤维素酶,放入摇床中震摇酶解(45℃, 30 min),酶解后冷冻离心(-5℃, 5 000 r/min, 20 min)得酶解上清液,用对上清液进行超滤浓缩,用环糊精包合后喷雾干燥制粒。

1. 3. 1. 1　生物酶解工艺在木瓜SOD提取上的效果研究

试验显示采用酶解工艺可以提高单位体积木瓜浆液离心所得上清液的体积,即提高了木瓜的出汁率,从而可以提高提取SOD的总酶活。故采用纤维素-果胶复合酶对木瓜打浆液进行酶解应用研究。通过试验选择酶解最佳参数为:酶解pH值为3,纤维素-果胶复合酶添加量为1. 2%,酶解温度为40℃,酶解时间为50 min。

1. 3. 1. 2　木瓜SOD的环糊精包埋修饰研究初探

β-环糊精和γ-环糊精包埋:木瓜SOD浓缩液分别加入1% 2% 3% 4%的β-环糊精或γ-环糊精,在25℃,真空搅拌3 h, 4℃冷藏10 h,离心分离上清液及沉淀,分别测定SOD活性。

包埋材料的选择和添加量主要考查包埋率。包埋率=沉淀物SOD总活性/(沉淀物SOD总活性+上清液SOD总活性)。

选择包埋率较高的材料和工艺制备木瓜SOD包埋物,探究其对热(70℃, 15 min)、酸(pH=1. 7, 15 min)和模拟胃液(15 min)处理的稳定性,考查其SOD活性的残留率。残留率=(处理后SOD总活性/处理前SOD总活性)×100%

1. 3. 1. 3　SOD粗提物制备过程SOD活性变化

实验显示,以γ-环糊精包埋,其木瓜SOD保留活性和稳定性较好,并以γ-环糊精为母核,以包埋浆液为喷液进行喷雾造粒,料液比为2∶1,喷雾造粒是物料温度为45℃。考查SOD粗提物制备过程SOD活性变化。

1. 3. 2　SOD粗提物生物学效应研究

1. 3. 2. 1　辐照模型

将50只小鼠分为5个组,空白对照组、模型对照组和3个受试样品剂量实验组。3个实验组灌胃每日给予0. 1 g/kg受试样品(受试样品用基础饲料稀释为1 000 U/kg、2 000 U/kg、3 000 U/kg),对照组给予同重量的基础饲料, 30 d后,除空白对照组外,各组给予5 Gy60Coγ射线全身性照射1次,照射后第3天处死各组动物,摘眼球取血,分离血清,剖腹取肝脏和肾脏,测定血清和组织中的MDA含量和SOD活性。

1. 4　统计学处理

数据均以-x±s表示,应用SPSS 13. 0统计软件进行,独立样本t检验。

2　结果

2. 1　SOD粗提物的加工工艺研究结果

2. 1. 1　酶解前后效果比较

以最优试验组合进行酶解试验,比较了木瓜浆液酶解前后的出汁率、单位体积上清液所含SOD酶活以及总酶活(以100 g木瓜,即300 g木瓜浆液汁)的变化。结果见表1。表1　酶解前后效果比较结果

项目出汁率(% )上清液(U/ml)上清液所含SOD总酶活(U)

酶解前45. 0±0. 2 180. 0±3. 0 4. 32×104±0. 007 2

酶解后92. 0±0. 3 166. 0±2. 2 4. 78×104±0. 006 3

2. 1. 2　木瓜SOD的修饰初探结果

2. 1. 2. 1　环糊精包埋对SOD包埋率的影响

环糊精包埋试验可以看出,当环糊精的添加量由1%到4%变化时,γ-环糊精的添加量从1%提高到3%时包埋率提高迅速,达到75. 5%,而当增加至4%时,包埋率仅提高到76. 1%,因此,γ-环糊精作为包埋物的合理添加量可选择3%;而β-环糊精的添加量为2%时,包埋率已达到75. 3%,与添加3%的γ-环糊精的包埋率接近,而随着β-环糊精的添加量进一步增加其包埋率并没有明显提高。故添加2%的β-环糊精和3%的γ-环糊精均可使木瓜SOD的包埋率达到75%。γ-环糊精和β-环糊精的添加量对木

瓜SOD包埋率的影响见图1。

2. 1. 2. 2　包埋物稳定性研究

将木瓜SOD环糊精包埋物分别通过加热(70℃, 15 min),加酸(pH=1·7, 15 min),人工胃液(15 min)处理后发现(-环糊精包埋物中SOD活性残留率分别为12%、0%、0%,β-环糊精包埋物中活性残留率分别为40%、52%、34%。

2. 1. 3　SOD粗提物制备过程中SOD活性的变化

从100 g木瓜原料制备的SOD粗提物中含SOD活性为3. 24×104U,活性保留率为67. 8%。图1　环糊精包埋对包埋率的影响

2. 2　SOD粗提物生物学效应研究

2. 2. 1　SOD粗提物对小鼠体内MDA水平的影响(表3)

与模型对照组相比, 1 000 U/kg剂量组中,血清中的MDA含量有极显著性差异(P<0·01),肝匀浆中的MDA含量有显著性差异(P<0.05),肾匀浆未见显著性差异(P>0·05);2 000 U/kg剂量组中,血清中、肝匀浆含量有极显著性差异(P<0·01),肾匀

浆组有显著性差异(P<0·05); 3 000 U/kg剂量组中,血清和各组织有MDA含量有非常显著的差异(P<0·01)。

表3　小鼠血清和组织中的MDA含量(n=10,-x±s)

组别血清

(nmol/ml)

肝匀浆

(nmol/mg)

肾匀浆

(nmol/mg)

空白对照组2. 581±0. 205 5. 247±0. 682 2. 558±0. 436

模型对照组2. 822±0. 265 6. 914±0. 141 2. 748±0. 199

实验组

1 000 U/kg 2. 370±0. 276b6. 678±0. 329a2. 687±0. 150

2 000 U/kg 2. 058±0. 138b6. 016±0. 344b2. 626±0. 093a

3 000 U/kg 1. 794±0. 154b5. 426±0. 286b2. 322±0. 322b

a:P<0·05,b:P<0·01,与模型组比较

2. 2. 2　SOD粗提物对小鼠体内SOD活力的影响(表4)与模型对照组相比, 1 000 U/kg剂量组中,血清、肝匀浆中SOD活性有极显著性差异(P<0·01),肾匀浆中SOD活性未见显著性差异(P>0·05); 2 000 U/kg剂量组中,血清、肝匀浆和肾匀浆中的SOD活性均有非常显著性差异(P<0·01); 3 000 U/kg剂量组中,血清、肝匀浆和肾匀浆中的SOD活性均有非常显著性差异(P<0·01)。

表4　小鼠血清和组织中的SOD活性(n=10,-x±s)

组别血清

(nmol/ml)

肝匀浆

(nmol/mg)

肾匀浆

(nmol/mg)

空白对照组61. 834±5. 479 41. 843±1. 953 50. 671±1. 284

模型对照组60. 077±1. 446 38. 729±2. 526 49. 843±1. 413

实验组

1 000 U/kg 69. 707±2. 600a48. 245±3. 273a51. 260±1. 642

2 000 U/kg 72. 806±1. 660b61. 406±3. 110b60. 832±3. 869b

3 000 U/kg 80. 399±2. 576b62. 18±6. 223b66. 204±2. 538b

a:P<0·05,b:P<0·01,与模型组比较

3　讨论

通过酶解工艺处理,出汁率提高了近100%,为SOD较为充分的从木瓜果肉组织中的游离出来提供了条件。从酶解前后上清液中SOD的变化也不难发现,虽然酶解后单位体积的上清液中SOD的活力比酶解前降低了7. 8%,但是由于出汁率大大提高,使得单位质量木瓜所得上清液中SOD总活力提高近10·65%。通过用纤维素-果胶复合酶进行酶解处理,大大降解了木瓜浆液中的纤维素和果胶物质及其对SOD的包裹或附着作用,同时也提高了SOD的提取总量。因此,酶解工艺运用于木瓜SOD的提取上是有理

论和实际意义的。

作为一种酶制剂, SOD的应用受许多因素的限制,如在机体内易于降解,生物半衰期短,常温保存易于失活等常用的解决方法之一是用化学修饰,环糊精、聚乙二醇、右旋糖酐、免疫球蛋白FC片段、聚烯属化合物等都曾经用于SOD的化学修饰[5]。对环糊精包合木瓜SOD的工艺和效果作初步探讨。

从稳定性试验可以看出,添加2%的β-环糊精的包埋物在经过特定的处理后,除了经过加热其SOD活性残留率还有12%外,经过酸处理和人工胃液后,均不能检测到SOD活性;而3%的γ-环糊精包埋物SOD活性残留率分别为40%、52%和34%。可见,采用

3%的γ-环糊精包埋木瓜SOD,在包埋率和SOD稳定性方面都相对好。经喷雾造粒技术制备SOD粗提物,其SOD活性保留率为67. 8%。

本实验室前期对木瓜中多酚类物质及其抗氧化作用进行了研究,而关于木瓜中SOD的生物学效应国内外少见报道。本研究采用了超滤浓缩的工艺排除了多酚类等小分子抗氧化物的影响,并采用环糊精修饰和喷雾造粒技术制备木瓜SOD粗提物颗粒产品。通过生物学实验结果可以看出,各剂量组中小鼠血清和组织中的MDA含量均低于模型对照组,而血清和组织中的SOD活性均高于模型对照组。表明木瓜SOD提取物颗粒能够有效降低小鼠体内MDA含量,可有效提高小鼠体内SOD活性,并呈现一定剂量效应关系。

由于木瓜SOD的相关研究还很少,本研究对其粗提物的修饰和生物学效应作了初步研究,显示木瓜SOD粗提取物颗粒能够有效降低小鼠体内MDA含量并提高小鼠体内SOD活性,为进一步开发利用木瓜拓宽了新的途径,同时也为大力开发植物SOD提供了新的思路。

参考文献:

[1]柳　蔚,杨兴海,钱京萍.资木瓜乙醇提取物镇痛抗炎作用的实验研究[J].四川中医, 2004, 22(8): 7-8.

[2]于　平.超氧化物歧化酶研究进展[J].生物学通报, 2006, 41(1): 4-6.

[3]张　婷,糜漫天,唐　勇,等.光皮木瓜多酚粗提物的体内外抗氧化效应[J].第三军医大学学报, 2007, 29(20): 1954-1957.

[4]吴克刚,柴向华.食品微胶囊技术[M].北京:中国轻工出版社,2006: 72-75.

[5]林庆斌,廖升荣,熊亚红,等.超氧化物歧化酶(SOD)的研究和应用进展[J].化学世界, 2006, 47(6): 378-381.