HPLC法测定清热解毒颗粒中大黄素在大鼠体内的药代动力学

清热解毒颗粒由中药配方颗粒虎杖、蒲公英、败酱草、半枝莲等中药组成,具有清热解毒、利咽消肿的功效,适用于治疗风热感冒,症见发热,咽喉肿痛,急性咽炎、急性支气管炎、单纯性肺炎等急性炎症[1.3]。其中虎杖具有活血散瘀,解毒消肿的功效,大黄素为该药材中主要有效成分,本文选择大黄素为研究成分,建立了一种简单、灵敏、快捷、准确的HPLC方法测定血浆中大黄素的方法,检测大鼠体内大黄素的含量及研究药代动力学特征。

1材料

1.1仪器美国Aglient1200高效液相色谱系统,FA200B电子分析天平,WH3微型旋涡混合仪,TG1850WS高速冷冻离心机。

1.2药品与试剂清热解毒颗粒(由深圳市三九现在中药有限公司生产,批号:1108002s),大黄素标准品(中国药品生物制品检定所提供,纯度≥98%,批号:100705-200811),大黄酸对照品(中国药品生物制品检定所提供,纯度≥98%,批号:110786201019)。

1.3动物20只雄性SD大鼠,体质量为(246±18)g,给药前禁食。

2方法与结果

2.1储备液的配制精密称取大黄素对照品10mg,置于50mL容量瓶中,采用乙腈溶解制成0:2mg/mL标准贮备液,于4℃冰箱中保存,备用。精密称取大黄酸内标物5mg,置于50mL容量瓶中,采用乙腈定容至相应刻度,再从中精密吸取1mL,定容至100mL容量瓶中,即得10ug/mL内标贮备液,于4℃冰箱中保存备用。

2.2血浆样品的预处理精密移取待测血浆100uL,置于10mL具塞离心管中,加人大黄酸内标物溶液50uL,再加人乙醚萃取2次,每次4mL,涡旋混合5mim,12000min高速离心5min,分取乙醚层,采用氮气流吹干,再用甲醇50uL溶解残渣,在旋涡混合器上震荡溶解,使残留物溶于甲醇,取20uL上清液进样。

2.3色谱条件[⒕]KromasⅡC1:柱(4,6mm×250mm,5um),检测波长为254nm,流动相为甲醇:0,1%磷酸溶液(80:20),流速为1mL/min,柱温为35℃。

2.4专属性按“血浆样品预处理”项下操作进行血样处理,分别制备空白血浆和空白血浆加对照品和内标的血浆样品。在上述色谱条件下,将以上处理好的血浆样本注人HPLC仪中,结果大黄素与内标大黄酸保留时间分另刂为9,8,11.6min,且峰形良好,空白血浆样本在相应的位置上未出现内源性杂质干扰成分。

2.5标准曲线的制备及最低检测限度精密移取以上配置好的大黄素标准储备液适量,加人空白血浆进行稀释,配置质量浓度为18,15,10,5,2,1,0,1ug/mL的大黄素对照品标准血浆。以后处理同“血浆样品预处理”项下操作。精密吸取20uL,注人液相色谱仪,按2.3项下测定峰面积。以大黄素的峰面积(Y)对进样浓度(X)进行回归,得回归方程Y=253.65X+3.752(R=0.9999),结果表明大黄素血药质量浓度在0.1~18,0u酽mL线性关系良好,最低检测限度为0.1ug/mL。

2.6回收率和精密度取空白血浆适量,加人标准储备溶液混合,配制成浓度高、中、低3种质量浓度为0,5,5,15ug/mL的大黄素QC样本,进样分析,记录大黄素的峰面积(Al);另取等量的大黄素标准溶液,配置质量浓度为0.5,5,15ug/mL,按照QC样品的血浆处理方法操作,记录大黄素面积为A2。以(A1/A2)之比乘以100%,计算回收率,以同样的方法连续测定3d,计算日间差和日内差,数据见表1。结果发现测得的回收率与日内、日间精密度良好,符合血浆样品分析要求。

2.7稳定性取空白血浆适量,加人标准储各溶液混合,配制高、中、低3种质量浓度为0.5,5,15ug/mL的质控血浆样品,分别于0,10,18,24h进行测定,比较不同时间点测定的质量浓度。根据表2数据结果分析,大黄素的浓度变化(5%,表明血浆样品在24h内稳定性良好。

2.8多次冻融试验结果配制高、中、低3种质量浓度为0,5,5,15ug/mL的质控血浆样品,即时进行含量测定;另外配置同样的血浆样品,于—40℃进行冷冻保存,解冻后再进行测定,连续3次,计算样品经3次冻融后大黄素浓度的变化。由表2数据分析可知,大黄素的浓度变化(10%,表明血样经3次冻融后稳定性较好。

2.9药代动力学测定取SD大鼠20只,随基分成两组,实验前夜禁食12h,取清热解毒颗粒适量,采用生理盐水溶解,灌胃给药,给药剂量为0.1g/kg,0,2g/kg,分别于给药前和给药后0,1,0。4,0.8,1.2,1.8,2.5,4,6,10,12,14,16h,从眼眶取血400uL,按照血浆样本处理方法进行处理,以上述色谱条件进行含量测定,获得血药-时间曲线(图2)。采用DA,1软件对大黄素的药-时曲线进行拟合,结果表明大黄素的药-时曲线符合二室模型,主要药动学参数结果见表3。

3讨论

本文采用KromaC1:柱(4.6mm×250mm,5 um),检测波长为254nm,流动相为甲醇:0.1%磷酸溶液(80:20),流速为1mL/min,柱温为35℃。在此检测条件下,大黄素的最低检测质量浓度可达0.1ug/mL,大黄素的保留时间为9.8mh左右,内标大黄酸保留时间为11,6min左右,大黄素、内标大黄酸及血浆中的干扰物质能得到很好地分离。所建立的HPLC测定大黄素的血浆药物浓度方法灵敏可靠,能满足临床药物代谢动力学研究的要求。从本实验结果分析,清热解毒颗粒中大黄素体内作用时间相对较长,且血药浓度和生物利用度随剂量增加而增大,表明临床上对于风热感冒比较严重的患者[5],可以适当增加剂量,提高药物治疗效果,该研究结果可为临床用药提供一定的指导意义。

参考文献

[1]黄霓晖,李勇敏,彭淑珍.清热解毒颗粒的抗炎作用研究[J].湖南中医药导报,2003,(05):64-65.

[2]韩育明,胡学军,曾松林.清热解毒颗粒治疗急性上呼吸道感染320例总结[J].湖南中医杂志,2003,(06):10-11.

[3]贾红慧,勾惊,包涵.清热解毒颗粒的抑菌、抗炎和解热作用研究[J].中药药理与临床,2007,(02):66-67.

[4]陈冬利,龙洪.清热解毒颗粒质量标准研究[J].中医药导报,2009,(02):72-76.

[5]张艳,李勇敏,彭淑珍.清热解毒颗粒的止咳化痰作用研究[J].湖南中医杂志,2006,(04):87-88.