糖尿病肾病与血液8羟基脱氧鸟嘌呤的关系

　　作者：潘勤,陈吉海,叶小珍,杜宏　　作者单位：210028 南京市，武警南京医院;南京军区南京总医院

　　【摘要】目的 探讨糖尿病肾病(DN)与血液8脱氧鸟嘌呤(8OHdG)之间的关系。方法 取41例DN患者作为DN组，65例正常体检者为正常对照组。用ELISA方法测定血液单核细胞DNA氧化损伤指标8羟基脱氧鸟嘌呤(8OHdG)水平。结果 DN组血液8OHdG水平较正常对照组血液8OHdG水平显著升高(P<0.01);DN组24 h尿白蛋白与血液8OHdG水平呈正相关(P<0.05)。结论 糖尿病肾病患者血液8OHdG水平较正常人明显升高。

　　【关键词】 糖尿病肾病,8羟基脱氧鸟嘌呤,DNA氧化损伤

　　DNA氧化损伤在糖尿病肾病的发病中起着重要作用，而8羟基脱氧鸟嘌呤(8OHdG)是DNA的氧化核酐，是DNA氧化损伤敏感的生物指标。我们对比了糖尿病肾病组(DN)与正常对照组血液8OHdG的水平。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　糖尿病肾病患者41例为DN组，男21例，女20例;65例正常体检者为正常对照组。入选标准：(1)年龄>30岁、不吸烟的糖尿病肾病患者;(2)24 h尿白蛋白≥30 mg/24 h或经肾脏穿刺活检确诊为糖尿病肾病(3)高血压患者入选前平卧位血压<180/110 mm Hg。排除标准：(1)吸烟;(2)长期使用抗氧化剂等影响氧化应激水平的药物治疗;(3)经尿检、肾脏穿刺活检等排除其他尿蛋白升高疾病(急、慢性肾小球肾炎等)。

　　1.2 方法

　　(1)提取DNA：对于符合条件的糖尿病肾病患者及正常对照组抽取5～10 ml空腹静脉血，使用盐析法提取DNA。(2)DNA浓度的计算和纯化：DNA在TE缓冲液中溶解至20～50 μg/ml;分别于230、260、280 nm三个波长检测吸光度，计算DNA的浓度(在波长为260 nm条件下，1.0对应于50 μg/ml DNA)，了解DNA的纯度。溶解200 μg DNA至135 μl水中;加入15 μl乙酸钠(200 mmol/L，pH 4.8)、6 U的核酸酶P1(15 μl，1 mg/ml)至DNA溶解液中，氩气环境下37℃下孵育30 min。然后加入1 mmol/L TrisHCl缓冲液(15 μl，pH 7.4)及2 U碱性磷酸酶(7 μl，200 U/0.7 ml，pH 7.4)，继续在氩气环境下37℃下孵育30 min。水解产物过纯化柱，以去除酶及其他大分子，14 000 r/min离心10 min。收集离心的液体，取50 μl DNA消化产物用于ELISA试剂盒检测。(3)ELISA试剂盒检测：使用ELISA试剂盒(IMKOGNW 050915E，Catalog No.KOG200S/E)检测提取的DNA中8OHdG的含量。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，相关性分析采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 正常对照组血8OHdG水平为(0.7±0.9)ng/ml，糖尿病肾病组血8OHdG水平为(3.5±1.9)ng/ml。2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 24 h尿白蛋白和8OHdG间呈正相关(r=0.334，P<0.05)。 见图1。

　　3 讨论

　　氧化应激被认为是糖尿病肾病重要发病机制之一[1]。在糖尿病肾病的患者中，由于体内抗氧化酶表达受到抑制[2];另一方面，机体产生的活性氧(ROS)和超氧自由基增多[3]。过多的ROS可以介导DNA的损伤[4]，同时还可激活己糖胺途径、多元醇等与糖尿病肾病发病有关的通路的激活，造成肾脏组织及间质细胞DNA的损伤和凋亡。

　　8OHdG是DNA中鸟嘌呤氧化损伤的产物，被认为是DNA氧化损伤的特异性标志[5]。本研究探讨了DN组与正常对照组间血液单核细胞DNA提取液中8OHdG水平的差异，并对病程、24 h尿白蛋白与血8OHdG之间进行相关性分析。并且该实验采用的静脉抽血提取样本的方式更为方便;并且，使用的ELISA方法，较目前的高效液相色谱法电化学检测法特异性、灵敏度更高。这些即利于现场及大型人群分析，同时也能排除尿液中多种代谢产物及杂质对结果的干扰。

　　我们的研究结果显示，糖尿病肾病组与正常对照组相比，血8OHdG显著升高，证实在糖尿病患者机体DNA氧化损伤较正常对照组明显增多。24 h尿白蛋白与血液8OHdG水平间呈正相关，提示伴随糖尿病肾病的进展，体内氧化应激的水平也逐渐升高;此外，病程虽与8OHdG间相关并不显著，提示随着样本量的扩大，两者间也可能会呈正相关趋势，并且由于糖尿病患者多由于病情隐匿，就诊不及时，因此患者提供的病程时长并不能完全反映真实病情。总之，上述结果提示在糖尿病肾病患者体内氧化应激水平较正常对照组高，且伴随病情进展，这种氧化应激的水平也可升高，两者间呈正相关，这也为抗氧化应激药物在糖尿病肾病中的治疗提供依据。

　　【参考文献】

　　1 Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications： a unifying mechanism.Diabetes，2005，54：16151625.

　　2 Hodgkinson AD，Bartlett T.The response of antioxidant genes to hyperglycemia is abnormal in patients with type 1 diabetes and diabetic nephropathy.Diabetes，2003，52：846851.

　　3 Nishikawa T，Edelstein D.Normalizing mitochondrial super oxide production blocks three pathways of hyperglycemic damage.Nature，2000，403：787790.

　　4 Ceriello A.New insights on oxidative stress and diabetic complications may lead to a “causal” antioxidant therapy.Diabetes Care，2003，26：15891596.

　　5 Bruner SD，Norman DP.Structural basis for recognition and repair of the endogenous mutagen 8oxoguanine in DNA.Nature，2000，403：859866