CHB患者MCP-1表达与肝活检组织学积分相关性研究

　　乙型肝炎是广泛流行的传染性疾病，该病严重威胁人类健康。乙型肝炎大部分是感染乙型肝炎病毒（HBV）引起的，该病的临床转归主要决定于HBV与宿主之间的相互作用，如病毒不能及时被清除可引起慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌等不良后果。慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的病理改变主要是肝脏正常组织结构的破坏和大量单个核细胞浸润。有资料研究显示单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）在抗病毒免疫中扮演着重要作用[1-4],但MCP-1在CHB患者血清和肝组织中的表达水平如何及是否参与了肝脏病理损伤时单个核细胞的浸润，目前尚未见报道。因此，作者以CHB患者血清和肝活检组织为研究对象，观察MCP-1表达情况及其与肝脏组织学分级、分期的关系，现分析如下。　　1资料与方法　　1.1一般资料收集2009年3月到2011年6月中国人民解 放军第一二三医院的CHB患者124例，其中，男性81例，女性43例，年龄21~65岁。患者符合CHB诊断标准[5].对照组为乙肝表面抗原阴性且体检正常的健康者，其中，男性12例，女性8例，平均年龄38.2岁。　　1.2仪器与试剂Trizol（美国Invitrogen公司），实时荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），MCP-1单克隆抗体、人MCP-1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R&D公司）。DNM-9602酶标分析仪（北京普朗公司），WD-94BB凝胶成像分析仪（北京六一仪器厂），DA7600荧光定量PCR仪（广州达安公司）。　　1.3标本收集采集CHB患者和对照组人群血液，室温自然凝固，3000r/min离心15min,收集血清后于-20℃保存待测。采用B超引导下经皮穿刺获取肝活检组织，一部分用10%甲醛固定，用于免疫组化或病理检查；另一部分-70℃保存，用于实时荧光定量PCR.　　1.4ELISA检测血清中的MCP-1水平按试剂说明书操作，标准品采用双复孔，以标准浓度曲线计算出待测血清MCP-1水平。　　1.5免疫组化检测MCP-1在肝组织中的表达水平用10%甲醛固定肝活检组织12~16h,石蜡包埋，4μm连续切片。经过烤片、脱蜡、梯度乙醇水化，然后以3%H2O2室温10min,PBS冲洗3min,连续3次；1%BSA室温10min,甩去BSA后加MCP-1单抗50μL（125稀释），4℃过夜；第2天PBS冲洗3次，每次3min;加辣根过氧化物酶标记二抗50μL,37℃孵育30min,PBS冲洗3次，每次3min;最后经DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明和中性树脂封片再镜检。免疫组化结果参照文献[6]进行半定量分析。　　1.6实时荧光定量PCR检测肝组织MCP-1基因表达首先按试剂说明书操作提取总RNA,进行cDNA的合成，根据MCP-1和β-actin特异基因序列设计引物，β-actin上游引物5′-AGCAAGAGAGGCATCCTCAC-3′，β-actin下游引AACATGATCTGGGTCATCTTC-3′；MCP-1上游引物5′-CTCATAGCAGCCACCTTCATTC-3′，MCP-1下游引物5′-CACAGCTTCTTTGGGACACTTG-3′。引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。　　1.7统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以狓±狊表示，组间比较采用狋检验，以犘<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1两组血清MCP-1表达水平比较对照组和CHB组血清MCP-1水平分别是（265±44）ng/L和（157±80）ng/L,CHB患者血清中MCP-1水平显着低于对照组，差异有统计学意义（狋=5.355,犘<0.01）。　　2.2MCP-1在肝活检组织中的表达RT-PCR结果显示：CHB患者肝组织MCP-1的基因相对表达量是0.0343±0.0323（β-actin为参照基因）。免疫组化结果显示：肝细胞、胆管上皮细胞、汇管区浸润的炎性细胞及窦周隙单个细胞均表达MCP-1.在病变部位附近的肝细胞，特别是增生的肝细胞MCP-1表达较强。胆管上皮细胞MCP-1也呈阳性表达；窦周隙散在的细胞MCP-1呈强阳性表达，从存在位置和形态学上分析，可能为星状细胞；汇管区和纤维形成区的浸润细胞MCP-1表达各异，大部分细胞不表达，形态学上判断可能主要为淋巴细胞；有部分细胞呈中度阳性表达，形态学判断可能为单核细胞；部分散在细胞MCP-1呈强阳性表达，与窦状隙散在的MCP-1阳性细胞相似。见图1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。　　2.3CHB患者MCP-1水平与肝组织炎症分级、纤维化分期的关系按病毒性肝炎分级、分期标准[5],肝组织纤维化分期为1~4期，炎症分级为1~4级。经统计学分析，CHB患者血清中MCP-1水平与肝组织炎症分级、纤维化分期呈正相关（狉=0.353,犘=0.011;狉=0.496,犘<0.01）。肝组织MCP-1mR-NA表达与炎症分级、纤维化分期呈正相关（狉=0.465,犘<0.01;狉=0.493,犘<0.01）。肝组织MCP-1蛋白表达与炎症分级、纤维化分期呈正相关（狉=0.486,犘=0.01;狉=0.542,犘<0.01）。见图2（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。　　3讨论　　MCP-1作为配体主要趋化表面携带其相应受体的单核/巨噬细胞，后者是机体抗感染的关键成分[7].相关实验数据显示，MCP-1在抗病毒感染[8-9]及多种疾病中发挥着重要作用[10].HBV感染后，细胞免疫应答对病毒清除起关键作用，如机体不能有效清除病毒，将引起不良后果。有研究显示CHB患者存在免疫功能失调[11-12].本研究发现CHB患者外周血 MCP-1水平低于对照组，表明HBV可能影响宿主细胞MCP-1表达以利于其自身生存。普遍认为趋化因子具有多源性[13-14].本研究发现CHB者肝活检组织的肝细胞、胆管上皮细胞、汇管区浸润细胞和窦状隙散在的细胞均不同程度的表达MCP-1,这与其他学者发现CHB患者肝细胞MCP-1表达呈阴性存在差异[14].本研究也发现，病变部位肝细胞表达MCP-1较强，提示MCP-1表达可能受局部因素影响。CHB患者肝脏炎症坏死区有大量淋巴细胞和单核细胞浸润，它们在活化状态下也可分泌大量细胞因子，这些细胞因子可能会诱导MCP-1表达。CHB患者肝脏病变特征为不同程度的炎症坏死和纤维化。　　本研究结果显示CHB患者血清中MCP-1水平及肝活检组织中MCP-1水平与肝组织炎症分级、纤维化分期均呈正相关，提示MCP-1在CHB致病机制中可能扮演着重要作用。活化的星状细胞在肝组织纤维化形成中起重要作用[15],体外培养人肝脏星状细胞表现出肌成纤维细胞样表型，且MCP-1以剂量依赖方式可刺激星状细胞迁移[16],因此可以认MCP-1在体内影响纤维化形成。纤维形成区和窦状隙浸润的星状细胞MCP-1表达呈强阳性，进一步证实其在促纤维化中的作用。CHB的发病机制很复杂，机体在与病毒相互作用过程中能否有效清除病毒是决定CHB患者转归的关键因素。本研究结果提示HBV可能通过下调宿主MCP-1表达以利于其自身生存，MCP-1与肝脏组织学积分相关，参与了肝组织的病理损伤过程，在CHB的致病机制中起着非常重要的作用。　　参考文献　　[1]AlmansaR,SociasL,Andaluz-OjedaD,etal.Viralinfectionisas-sociatedwithanincreasedproinflammatoryresponseinchronicobstructivepulmonarydisease[J].ViralImmunol,2012,25（4）：249-253.　　[2]ZaninV,DelbueS,MarcuzziA,etal.Specificproteinprofileince-rebrospinalfluidfromHIV-1-positivecART-treatedpatientsaf-fectedbyneurologicaldisorders[J].JNeurovirol,2012,18（5）：416-422.　　[3]KhiatiA,ChaloinO,MullerS,etal.Inductionofmonocyteche-moattractantprotein-1（MCP-1/CCL2）geneexpressionbyhumanimmunodeficiencyvirus-1TatinhumanastrocytesisCDK9de-pendent[J].Neurovirol,2010,16（2）：150-167.　　[4]CorstenMF,SchroenB,HeymansS.Inflammationinviralmyo-carditis:friendorfoe[J].TrendsMolMed,2012,18（7）：426-437.　　[5]中华医学会传染病与寄生虫病学会分会，肝病学分会。病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志，2001,19（1）：56-62.　　[6]SoslowRA,DannenbergAJ,RushD,etal.COX-2isexpressedinhumanpulmonary,colonic,andmammarytumors[J].Cancer,2000,89（12）：2637-2645.　　[7]JinL,GetahunA,KnowlesHM,etal.STING/MPYSmediateshostdefenseagainstListeriamonocytogenesinfectionbyregula-tingLy6C（hi）monocytemigration[J].JImmunol,2013,190（6）：2835-2843.　　[8]SunL,CornellTT,LeVineA,etal.Dualroleofinterleukin-10intheregulationofrespiratorysyncitialvirus（RSV）-inducedlunginflammation[J].ClinExpImmunol,2013,172（2）：263-279.　　[9]KokWL,DenneyL,BenamK,etal.Pivotaladvance:invariantNKTcellsreduceaccumulationofinflammatorymonocytesinthelungsanddecreaseimmune-pathologyduringsevereinfluenzaavirusinfection[J].JLeukocBiol,2012,91（3）：357-368.　　[10]ChaaitanyaIK,MuruganandamN,SundaramSG,etal.Roleofproinflammatorycytokinesandchemokinesinchronicarthropa-thyinCHIKVinfection[J].ViralImmunol,2011,24（4）：265-271.　　[11]ChangJ,BlockTM,GuoJT.Theinnateimmuneresponsetohep-atitisBvirusinfection:implicationsforpathogenesisandtherapy[J].AntiviralRes,2012,96（3）：405-413.　　[12]RawatS,ClippingerAJ,BouchardMJ.ModulationofapoptoticsignalingbythehepatitisBvirusXprotein[J].Viruses,2012,4（11）：2945-2972.　　[13]DeshmaneSL,KremlevS,AminiS,etal.Monocytechemoattrac-tantprotein-1（MCP-1）：anoverview[J].JInterferonCytokineRes,2009,29（6）：313-326.　　[14]AlmajhdiFN,Al-QudariAY,HussainZ.Differentialexpressionoftransforminggrowthfactor-β1andHBxenhanceshepatitisBvirusreplicationandaugmentshostimmunecytokinesandchemo-kines[J].AnnHepatol,2013,12（3）：408-415.　　[15]SenooH,YoshikawaK,MoriiM,etal.Hepaticstellatecell（vita-minA-storingcell）anditsrelative-past,presentandfuture[J].CellBiolInt,2010,34（12）：1247-1272.　　[16]TsukamotoH,ZhuNL,WangJ,etal.Morphogensandhepaticstellatecellfateregulationinchronicliverdisease[J].JGastroen-terolHepatol,2012,27Suppl2:94-98.　　（收稿日期：2013-11-25）