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《肾脏病学》

GnRH类似物对体外肝癌细胞Hsp90表达的影响及其意义

发表时间:2014-01-21  浏览次数:848次

近年研究发现肝癌细胞为GnRH自分泌细胞,GnRH能够促进肝癌细胞的凋亡,热休克蛋白90(Heat shock protein90, HSP90)作用于细胞的抗凋亡机制,在肝癌的发生发展中起着重要作用。本研究拟用不同浓度GnRH类似物阿拉瑞林刺激HepG2 肝癌细胞,观察其增殖阻抑作用并观察Hsp90的变化,为应用 GnRH类似物及Hsp90拮抗剂治疗原发性肝癌提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料:人肝癌细胞系HepG2购于西安第四军医大学细胞中心。Hsp90单克隆抗体及SP试剂盒购自武汉博士德生物公司; GnRH类似物阿拉瑞林购自重庆川康派德公司;MTT试剂盒购自晶美生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 噻唑蓝(MTT)比色:①细胞培养:HepG2肝癌细胞系常规培养,制备浓度为2×104个/ml单细胞悬液,以每孔200 μl接种于96孔培养板中。取10-3 mol/L、10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/ L、10-7 mol/L 5个浓度组阿拉瑞林培养24 h。②呈色:每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl孵育4 h终止培养,取上清液。每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min充分溶解。③比色:选择490 nm 波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值,记录结果。抑制率 =1-加药组OD值/对照组OD值计算抑制率及IC50(半抑制率)时的阿拉瑞林浓度。

1.2.2 免疫组织化学染色及图像分析:以IC50时的含阿拉瑞林培养液,于六孔板中分别培养HepG2肝癌细胞24 h、48 h,同时常规培养HepG2肝癌细胞做对照。将长有HepG2肝癌细胞的盖玻片从六孔板中取出,无水乙醇固定5 min,玻片分别经0.3%甲醇双氧水和1 g/L PBS处理30 min后,滴加正常羊血清孵育30 min;滴加Hsp90单克隆抗体(释度均为1:100)后4℃湿盒内孵育过夜; PBS冲洗后滴加l:100稀释的SP试剂盒室温下孵育1 h;最后滴加 DAB显色,镜下观察控制反应强度。PBS代替第一抗体进行孵育作阴性对照。应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统测定其积分光密度(Integral optic density,IOD)值。在光学显微镜下随机选取5个视野进行测定,所得IOD值的平均值为最终值。

1.3 统计学分析:使用SPSS 10.0对各项资料进行统计、分析,各项参数以均数±标准差( s x ± )表示,采用t和χ2检验,以P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色结果:

2.2 积分光密度(IOD)测定结果:对照组(1组)10例,IOD 值(2 036.10±95.43);Alarelin(24 h,2组)10例,IOD值(1 756.87±65.56);Alarelin(48 h,3组)10例,IOD值(1 248.08±97.35)

2.3 统计学分析结果:见表2。认为各组间差异有统计学意义(P<0.05),Alarelin处理后HepG2肝癌细胞hsp90表达减少。

3 讨论实验研究和临床观察均证实肝癌细胞上存在GnRH结合位点,GnRH类似物在体外可通过增加细胞的凋亡抑制肝癌的生长。Pati等亦证实在人肝癌细胞系HepG2中有GnRH受体存在,并且GnRH类似物能够抑制HepG2细胞增殖[1]。在细胞凋亡的过程中,经线粒体通路介导的凋亡信号其重要的特征是凋亡体的形成。研究表明HSP90通过阻断Apaf-1寡聚化,最终阻断凋亡体的形成[2]。HSP90对凋亡体的调节是通过其分子伴侣功能来实现,提示对HSP功能的调节将直接影响其对凋亡体的调控作用。HSP90对死亡受体通路介导细胞凋亡的调控作用是通过维持RIP的稳定性,提高NF-B的活性,从而介入阻断TNF诱导的细胞凋亡,HSP90还通过调节AKT激酶而间接影响NF-B的活性。死亡受体介导的凋亡信号还可以通过由促凋亡蛋白Bid介导线粒体凋亡通路的活化,当Bid蛋白被剪切活化后可以由胞浆转移到线粒体,启动线粒体凋亡通路。新近的实验揭示Bid蛋白也属于 HSP90的底物蛋白,过表达HSP90可以保护Bid免于被切割和活化,从而阻断TNF诱导的细胞凋亡[3]。肝癌组织中Hsp90的表达与肿瘤的分化程度以及肿瘤大小密切相关[4]。肝癌的内分泌治疗作为一种高效低毒的治疗方法,日益引起广大学者重视。GnRH类似物及Hsp90抑制剂均是近几年肿瘤治疗领域研究的热点之一,两者均能同时产生多路径抗肿瘤效应。笔者在研究中发现,Hsp90在GnRH促进HepG2肝癌细胞凋亡的过程中表达减少并与时间呈正相关,GnRH可能通过降调Hsp90 发挥其对HepG2肝癌细胞的增殖阻抑作用,从而为临床联合应用 GnRH类似物及Hsp90拮抗剂治疗原发性肝癌提供参考。

4 参考文献

[1] Teplan I.Development and investigation of some peptides with antitumor activity[J].Acta Biol Hung,2000,51(1):1.

[2] Pandey P,Saleh A,Nakazawa A,et al.Negative regulation of cytochrome C-mediated oligomerization of Apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90[J].EMBO J,2000,19(16):4310.

[3] Zhao C,Wang E.Heat shock protein 90 suppresses tumor necrosis factor alpha induced apoptosis by preventing the cleavage of Bid in NIH3T3 fibroblasts[J].Cell Signal,2004,16(2):313.

[4] 吴胜利,潘承恩,牛新捷,等.原发性肝癌中hsp90的表达及意义[J]. 中华肝胆外科杂志,2003,9(2):88.

[收稿日期:2013-10-17 编校:郑英善]

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