采用ELISA差减分析法探讨武汉地区中老年患者IEM HBsAg的携带状态

　　以相同或不同方法或试剂对临床标本做比对检测曾对乙型肝炎病毒(HBV)免疫标志物(HBVm)检测技术的发展起到过重要推动作用[12]，但它在诊断中潜在的临床价值则较少有人关注。笔者曾在HBV 免疫逃逸变异表面抗原(IEM HBsAg)的临床检测中对这一实验方式的临床诊断价值进行过探讨[23]，并将其用于既往中老年HBV 感染者血清IEM HBsAg的临床检测。现总结如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　待检血清1641例，男性1059例，年龄52～79岁，于2008年3～11 月自本院及市内周边医院采集，分离血清，置-20 ℃冻存至检测，既往均有乙型病毒性肝炎(简称乙肝)病史，近年内血清HBVm 检测1项以上阳性3次。对照血清52例，采自华中科技大学2006年度体检新生，全部新生于1年内接种乙肝疫苗，无肝炎病史，临检、生化与其他免疫学指标均正常。

1.2　仪器与试剂　抗HBsG6 mAbIgG(G6 mAb)为同济医院医学实验中心制备[2];抗HBsE2 mAbIgG(E2 mAb)亦由该中心收集并提供，该抗体针对HBsAg“a”决定簇，以其为原料制备的市售试剂具有很好的特异度、灵敏度及稳定性[3]。酶联免疫吸附法(ELISA)包被板条购自深圳保安塑料制品公司;酶标记抗HBs(抗HBsHRP)及其他ELISA 辅助试剂由郑州安图绿科生物工程有限公司提供。rG145R HBsAg由同济医院医学实验中心制备[4];雅培化学发光试剂与HBsAgELISA检测高浓度质控血清(卫生部临床检验中心颁布)等自市售购得;小鼠抗HBs多克隆抗体由中国国药集团武汉生物制品研究所赠送。

1.3　方法

1.3.1　血清HBsAgELISA 的建立　G6ELISA 采用二步法双抗体夹心ELISA，操作流程如下：(1)将G6mAb以pH9.3碳酸盐缓冲液稀释，加至酶标反应板各孔中，每孔100μL，4 ℃ 放置过夜。(2)以PBST 洗涤5次，每次1 min，加入2%BSA，每孔100μL，置37 ℃ 2h。(3)弃封闭液，加入不同稀释度待测标本与阴、阳性对照物，每孔50μL，37 ℃ 反应30 min。(4)同上洗板，每孔再加入50μL 羊抗HBsHRP，37 ℃ 反应30min。(5)同上洗板，加入TMBH2O2 溶液显色15 min，以2mol/L H2SO4 终止反应，置酶标仪上，450nm 波长测定A 值，以P/N≥2.1判为阳性。E2ELISA 同上述二步法双抗体夹心ELISA 检测。除包被抗体采用抗HBsE2 mAb 外，其他辅助器材、试剂及其操作方法等均与G6ELISA 相同。

1.3.2　方法特征考核　采用替代实验、系列稀释实验以及批内与批间重复实验对方法的特异度、灵敏度与稳定性进行考核，具体实验方法见既往文献报道[3]。

1.3.3　血清HBsAg 化学发光检测　采用雅培公司生产的化学发光试剂，在I2000化学发光系统上进行检测。

1.3.4　中和实验　中和实验以G6ELISA 为基础。将鼠抗HBsIgG 稀释至10.0μg/mL，与等体积G6ELISA 阳性血清混匀，37 ℃反应30min后，取100μmol/L 混合物加至反应孔中做G6ELISA，并根据未中和孔计算其中和率[3]。1.4　统计学处理　采用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ 2 检验，犘<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　方法的建立与考核

2.1.1　特异度　以2 种不同抗HBsmAb包被，在市售试剂基础上建立检测血清HBsAgG6ELISA 及E2ELISA，采用抗原替代实验对二法的特异度进行考核，实验结果见表1。

2.1.2　灵敏度　将卫生部临床检验中心HBsAg检测ELISA质控物系列稀释后，采用2种自制HBsAg检测试剂以上述方法进行测定，以P/N≥2.5(或OD≥0.10)为阳性标准，对其灵敏度进行评价。当质控物含量在0.0625ng/mL 时，2种方法450nm 处的A 值分别为0.172与0.126。由此认定2种方法的灵敏度大致相似。

2.1.3　稳定性　将卫生部临床检验中心HBsAg检测ELISA质控物准确稀释至2.00ng/mL，采用G6ELISA 及E2ELISA试剂做重复检测(10 次)，以评价方法的稳定性。结果G6ELISA 的批内和批间变异系数(犆犞)分别为7.8%、9.4%，E2ELISA 的批内和批间犆犞分别为8.4%、11.9%。

2.2　血清HBsAg的对比检测

2.2.1　检测阳性率比较　采用G6ELISA 与E2ELISA 对本组血清进行ELISA 差减分析检测，2 种方法阳性率分别为29.37%与29.01%，前者阳性率较后者略高(犘>0.05);G6ELISA 阳性、E2ELISA 阴性标本6 例，而G6ELISA 阴性标本无一例E2ELISA 呈阳性结果。

2.2.2　阳性反应强度的比较　对476 例G6ELISA 与E2ELISA 同时阳性标本的检测信号强度进行分析，2 种方法A值大致相当者384例(占80.70%，相差在30% 以内)，存在一定偏差者73例(占15.30%，相差31%～99%)，前者A 值大于后者达100%或以上者19例。此19例中有7例E2ELISA 产物A 值小于0.5，12例A 值为0.5～1.43，除1例低值标本外，其余标本A 值均为G6ELISA 大于E2ELISA。

2.3　G6ELISA 单独阳性标本的特异度验证

2.3.1　抗HBs中和实验　6 例血清非中和孔平均A 值为0.965，中和孔平均A 值为0.182，抗HBs中和率均大于70%[平均(81.14±6.45)%]。 ·130· 国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2

2.3.2　广谱试剂印证复核　采用雅培I2000 化学发光系统及其配套试剂对上述对比分析阳性(G6ELISA 检测阳性而E2ELISA 检测阴性)血清进行复核，全部血清均呈阳性反应，阳性符合率达100.00%，HBsAg 定量检测的范围为1.7～55.6IU/mL。2种方法实验信号强度的相关性并不明显。

2.3.3　单项检测阳性标本HBVm 的比较　对6 例单独G6ELISA 阳性血清标本其他HBVm 表达状态进行检测，实验结果见表2。

3　讨　　论

对HBVm 临床检测技术的研究推进了检验技术的发展，但其在临床诊断中的潜在价值却一直被忽略。血清IEM HBsAg的发现是这种潜在价值的偶然体现[57]。Ijaz等[6]及Louisirirotchanakul等[7]的研究组先后采用不同临床检测试剂，对1组IEM HBV 感染高危倾向人群做对比检测，发现单一试剂阳性标本中包含着少量IEM HBV 感染者，其诊断经抗HBs中和、HBV DNA 检测及直接法DNA 测序证实。Bowden[8]在综合分析大量比对检测资料后，提出不能轻率否定单一试剂检测阳性患者存在HBV 感染的可能性，在HBV 感染低发的欧美国家，这一结果需经血清HBV DNA 检测进行确认。

近十余年来，HBV 感染筛查方法与试剂的研发历经了2个主要阶段。前一阶段主要致力于实验方法特异度、灵敏度、稳定性与简便性等技术特征的改善;2005～2010 年则致力于通过对抗HBs原料的进一步优化提升其对IEM HBsAg检测的性能[3，89]。研发过程中比对结果的差异早期通常归因于实验方法在特异度、灵敏度与稳定性上的差异，最近有学者将其归因于不同试剂对IEM HBsAg的检测能力的差异[3，57]。为证实这一推测，笔者所在单位曾致力于高IEM HBsAg检测能力抗体的制备研究，提出ELISA 差减分析的设想，将这些成果用于临床检测，并取得与Ijaz等相似的实验结果[23，6，9]。

ELISA 差减分析系指采用2 种对wtHBsAg 灵敏度大致相同的试剂或市售试剂做比对检测，并将IEM HBsAg检测能力较强的试剂单一阳性者判定为IEM HBsAg阳性，以期直观地发现部分呈优势表达的IEM HBsAg阳性者。这种简便方法在最初提出时，笔者及其他研究者并未刻意对检测方法进行严格限定，亦未能考虑更多的实验细节。本研究则以2种经反复验证的抗HBs做包被，在其他实验试剂及其操作条件完全相同的前提下，同步建立2 种相似的HBsAgELISA 法，以期待其结果具有较好的可比性。

在此实验条件下对1641例临床患者进行检测，检出6例单一G6ELISA 阳性的临床患者，并发现一定数量2种方法检测A 值相差较大的标本。采用中和实验及雅培化学发光试剂进行复核，此6例标本的HBsAg特异度亦均得以证实，ELISA差减分析比对实验理念能够成立[3，67]。本研究结果提示本地区既往HBV 感染中老年人群中聚集着一定数量的IEM HBV感染者(包括优势或伴随感染)。

本组中高龄IEM HBV 感染者的聚集可能与如下因素有关：(1)入选对象HBV 感染的长期存在为突变提供了充裕的时间;(2)系统治疗尤其是西医抗病毒治疗为病毒突变提供人为的动因;(3)抗HBV 尤其是既往乙肝疫苗接种诱导的中高滴度抗HBs持续存在为HBVS基因的突变提供了进一步的免疫动力。

既往的流行病学调查显示，中老年乙肝患者体内病毒复制水平下降、血清HBsAg 自然阴转比例增加、社会活动范围及其对社会影响显著缩小，这些因素导致该类人群在HBV 感染流行病学中的价值长期未得到应有的重视[1011]。加之东亚人种对HBV 的易感性极高，现行疫苗诱导抗HBs对IEM HBV感染的预防无能，长辈对间代子女的过分溺爱，不文明养育方式的残留(尤其在中老年人群)，以及社会对HBV 感染经生活接触传播的不断弱化[1012]，使得国内中老年乙肝患者在HBV尤其是IEM HBV 的传播中发挥了重要作用，应引起医务工作者的重视。

参考文献

[1] LyTD，ServantDelmasA，BagotS，etal.SensitivitiesoffournewcommercialhepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)assaysindetectionofHBsAg mutantforms[J].JClin Microbiol，2006，44(7)：23212326.

[2] LiFH，ZhangCY，LiuJH，etal.Preparation，identification，andclinicalapplicationofantiHBs monoclonalantibodythatbindsboth wildtypeandimmuneescape mutant HBsAgs[J].FrontMedChina，2009，3(3)：277283.

[3] 李方和，李佩珊，刘静华，等.ELISA 差减分析———一种简便实用的免疫逃逸变异HBsAg检测新方法[J].中国免疫学杂志，2010，26(7)：642645，654.

[4] 张波，李方和，龚劲松，等.重组G145R HBsAg亲和纯化方法的建立及其应用[J].中国生物制品学杂志，2007，20(10)：767770.

[5] ColemanPF.DetectinghepatitisBsurfaceantigen mutants[J].EmergInfectDis，2006，12(2)：198203.

[6]IjazS，TorreF，TedderRS，etal.NovelimmunoassayforthedetectionofhepatitisBsurface"escape"mutantsanditsapplicationinlivertransplantrecipients[J].J Med Virol，2001，63(3)：210216.

[7] LouisirirotchanakulS，KanoksinsombatC，Theamboonlert A，etal.Mutationofthe"a"determinantof HBsAg withdiscordantHBsAgdiagnostickits[J].ViralImmunol，2004，17(3)：440444.

[8] BowdenS.Serologicaland moleculardiagnosis[J].Semin LiverDis，2006，26(2)：97103.

[9] 刘静华，黄永国，张春燕，等.乙肝泛变异HBsAg检测方法的建立及其在临床的初步应用[J].中国实验诊断学，2008，12(10)：11991203.

[10]骆抗先，何超.老年人中的无症状乙型肝炎病毒感染[J].中华流行病学杂志，1992，13(2)：6567.

[11]刘丽珍.老年人无症状乙肝病毒感染特征的探讨[J].中国冶金工业医学杂志，1994，11(4)：236.

[12]WeberB.GeneticvariabilityoftheSgeneofhepatitisBvirus：clinicalanddiagnosticimpact[J].JClin Virol，2005，32(2)：102112.