急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲

　　.【摘要】目的：研究急性髓性白血病病人外周血中肿瘤抑制基因RIZ1的表达状况和该基因启动子区甲基化状态及两者之间的关系。方法：以37例初发急性髓性白血病病人和15例正常人外周血标本为研究对象。RTPCR检测RIZ1 mRNA水平,甲基化特异性PCR(MSP)检测RIZ1基因启动子区甲基化状态。结果:急性髓性白血病病人标本与正常人标本比较,RIZ1基因的表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。急性髓性白血病标本中RIZ1基因启动子区甲基化率为29.7%(11/37)。存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本中,RIZ1基因表达缺失或降低。结论：RIZ1基因表达下降与急性髓性白血病的发生有关, 其部分机制在于基因启动子区甲基化。

　　【关键词】 急性髓性白血病; RIZ1基因; DNA甲基化

　　Study on the relationship between the RIZ1 gene expression and methylation　status of the gene promoter in acute myeloid leukemia　YAO Chen1, FANG Juanjuan1, Gao Li li1, DING Jiahua2,　SHU Guo fang3, YU Weiping1(1. Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medical Science, Southeast University, Nanjing 210009,　China; 2. Department of Hematology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China; 3. Center　of Clinical Laboratory Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the expression of RIZ1 gene in acute myeloid leukemia and to analyze the relationship between this alteration and the promoter hypermethylation of RIZ1 gene. Methods: The expression of RIZ1 mRNA in peripheral blood from 37 patients of primary acute myeloid leukemia samples and in peripheral blood from 15 normal persons samples was detected by reverse transcripitionpolymerase chain reaction(RTPCR). Methylationspecific PCR(MSP)was used to assay the methylation of RIZ1 gene promotor region. Results: Compared with normal person, the RIZ1 gene expression level decreased significantly in acute myeloid leukemia(P<0.05). The Methylation rate was 29.7%(11/37) in acute myeloid leukemia. The expression of RIZ1 mRNA was found to be lower in the acute myeloid leukemia samples with RIZ1 promoter methylation. Conclusion: Downregulation of RIZ1 gene expression plays an important role in the development of acute myeloid leukemia, and this alteration is partially caused by RIZ1 gene promoter methylation.

　　[Key words] acute myeloid leukemia; RIZ1gene; DNA methylation

　　RIZ1是定位于1p36的一个肿瘤抑制基因, 属于核蛋白甲基转移酶超家族成员。RIZ1失活在多数肿瘤中常见, RIZ1 mRNA表达下降或缺失常与RIZ1启动子区甲基化有关。研究已经发现,肿瘤抑制基因RIZ1 mRNA表达缺乏既见于急性髓性白血病细胞株AML193又见于慢性髓性白血病细胞株K562,提示该现象属于髓性白血病的分子改变之一。采用转基因方法证实RIZ1具有髓性白血病细胞凋亡诱导作用[1]。本研究收集急性髓性白血病病人外周血标本,对RIZ1 mRNA及其甲基化状态进行检测,旨在探讨急性髓性白血病病人RIZ1基因的表达状况及其甲基化状态。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本的来源

　　37例急性髓性白血病病人外周血标本取自东南大学附属中大医院血液科发病初期的病人,其中男21例,女16例,中位年龄44岁。按FAB标准分型：M15例,M211例,M38例,M510例,M63例。15例健康志愿者的外周血标本作为正常对照,中位年龄38岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 RIZ1 mRNA的检测 (1) 单个核细胞分离与裂解：取肝素抗凝血5～10 ml, 生理盐水缓冲液稀释后,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,经生理盐水洗涤后Trizol裂解,-80 ℃保存。(2) 提取总RNA：采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)并按其说明操作。通过紫外分光光度计(HITACH U2001)测RNA纯度和浓度。取OD260 nm/OD280 nm值在1.8～2.0范围内的产物进行逆转录。(3) cDNA的合成：按TaKaRa RTPCR试剂盒说明书操作,取2.0 μg总RNA进行逆转录反应。反应体系为20 μl,包含10×RT buffer 2.0 μl,2.5 mmol•L-1 MgCl2 4.0 μl,10 mmol•L-1 dNTP 2.0 μl,Olid(dT)1.0 μl,RNase inhibitor 0.5 μl,AMV 1.0 μl,无RNase水补足反应体系。反应条件为：30 ℃ 10 min,42 ℃ 20 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。获得产物置-20 ℃保存。(4) RIZ1基因的扩增：以获得的cDNA为模板通过PCR仪(Eppendoff公司)扩增该基因。RIZ1基因引物由上海英骏生物技术有限公司设计及合成。上游序列为5′GAAGT GAGGCTTTTCCCTTCT3′, 下游序列为5′CTCAGGGTTGTCTTCCCCA3′,扩增的片段长度为357 bp。以βactin为内参,上游序列为5′GCAAGAG

　　AGGCATCCTCACC3′,下游序列为5′GCACAGCCTGG

　　ATAGCAACG3′,扩增的片段长度为240 bp。以pRIZ1 RH质粒(由加拿大Saskatchewan大学癌症研究中心提供)为模板作为阳性对照,灭菌去离子水为阴性对照。反应体系为50 μl,包含5×PCR buffer 10 μl,20 pmol•L-1上、下游引物各0.5 μl,cDNA 10 μl,Taq DNA聚合酶1 μl,灭菌去离子水补足体系。反应条件为：95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,退火温度RIZ1 53 ℃/βactin 65 ℃ 30 s,72 ℃1 min,共40个循环;72 ℃延伸10 min。产物电泳应用FR200紫外可见分析装置(上海复日科技有限公司)和smart view TM 2001生物电泳图像分析软件对电泳条带进行分析。RIZ1 mRNA相对含量=RIZ1条带密度/βactin条带密度。

　　1.2.2 RIZ1基因甲基化的分析 应用DNA提取试剂盒(北京天根公司)及甲基化修饰试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)并按其说明书操作,提取所有标本中单个核细胞DNA并加以甲基化修饰。采用甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR, MSP)法,使用非甲基化与甲基化两对引物检测标本中RIZ1基因的甲基化状态。引物设计参照文献[2]报道,由上海英骏生物技术有限公司合成。非甲基化引物的上游序列为5′TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3′,下游序列为5′ACTATTTCACCAACCCCAAGA3′;甲基化引物上游序列为5′GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3′, 下游序列为5′GCTATTTCGCCGACCCCGACG3′;扩增的片段长度分别为175 bp和177 bp。PCR反应条件：95 ℃10 min,94 ℃ 30 s,退火温度56 ℃(非甲基化)/68 ℃(甲基化)45 s,72 ℃1 min,共40个循环;最后72 ℃延伸10 min。获得产物电泳、摄像,并随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各1例进行测序分析。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 11.5统计软件,均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 RIZ1基因mRNA表达状况

　　RTPCR检测结果表明,37例急性髓性白血病病人和15例正常对照者外周血标本中,RIZ1 mRNA相对含量的平均值分别为0.50±0.20与0.79±0.12,急性髓性白血病病人外周血中RIZ1 mRNA表达低于正常对照者,差异有显著性(P<0.05)。其中15例急性髓性白血病病人外周血标本RIZ1 mRNA表达降低或缺失(图1)。

　　M. 100 bp DNA相对分子质量Marker; 1. 正常人标本; 2. 阴性对照; 3～6. 急性髓性白血病病人标本; 7. 阳性对照

　　图1 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中RIZ1 mRNA表达状况

　　Fig 1 Expression of RIZ1 mRNA in acute myeloid leukemia and normal samples2.2 RIZ1启动子区甲基化状态

　　MSP法分析表明,37例急性髓性白血病病人外周血标本中11例存在RIZ1启动子区甲基化,甲基化率为29.7%(11/37)。15例正常人外周血标本均为非甲基化。图2显示部分标本检测结果,在急性髓性白血病标本中,3、4、12和21号标本扩增出175 bp的U片断和177 bp的M片断,说明存在RIZ1启动子区甲基化;而9和15号标本仅扩增出175 bp的U片断,说明RIZ1启动子区未甲基化;8号正常标本只扩增出175 bp的U片断,也说明RIZ1启动子区未甲基化。

　　Marker. DNA相对分子质量标记; M. 甲基化条带(177 bp); U. 未甲基化条带(175 bp); 1、2、3、5、6、7. 3、4、9、15、12和21号病人标本; 4. 8号正常标本

　　图2 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中RIZ1基因甲基化状态

　　Fig 2 Methylation status of RIZ1 gene in acute myeloid leukemic and normal samples2.3 MSP产物测序分析

　　随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各1例进行测序,结果与GenBank中RIZ1基因启动子区的序列作对比,可见未甲基化产物中的胞嘧啶全部替换为胸腺嘧啶,未甲基化序列中的C经修饰则转变为T;而甲基化产物所有CpG对应的胞嘧啶均保持不变,CpG以外的胞嘧啶则替换为胸腺嘧啶,从而证实受检MSP产物是RIZ1基因启动子区的部分序列,甲基化序列中CpG的C未被硫化,仍为C。换言之,MSP产物测序结果中,存在CpG表明CpG甲基化,存在TpG表明CpG未甲基化(图3)。因此,该测序结果表明本研究中MSP法分析可靠。

　　N(GenBank:AF472587.1 61-961)

　　TCCG AC TG G AGTC A A GA TGG CGG CGG CG CGG

　　A. 4号未甲基化样本测序结果

　　N(GenBank:AF472587.1 61-961)

　　TCCG ACTGG AGTC A AGA TG G CGG CGG CG CGG

　　B. 12号甲基化样本测序结果

　　图3 RIZ1基因启动子区未甲基化与甲基化样本的测序结果

　　Fig 3 Sequencing results of RIZ1 gene promoter unmethylation and methylation samples2.4 RIZ1启动子区甲基化状态与基因表达的相关性

　　在RIZ1表达降低或缺失的15例急性髓性白血病病人外周血标本中, 11例存在RIZ1启动子区甲基化,甲基化率为73.3%(11/15)。在37例急性髓性白血病病人外周血标本中,甲基化率为29.7%(11/37)。11例RIZ1启动子区甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本的RIZ1 mRNA相对含量的平均值为0.40±0.22;26例RIZ1启动子区未甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本的RIZ1 mRNA相对含量平均值为0.54±0.18,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明急性髓性白血病病人外周血中RIZ1启动子区甲基化者mRNA表达水平低于启动子区未甲基化者。

　　3 讨 论

　　人类多种癌症如胃癌、肝癌、甲状腺癌、结直肠癌及骨肉瘤等,RIZ1表达缺失[3-5]。方娟娟等[6]研究发现乳腺癌患者组织中存在RIZ1基因表达的改变,提示RIZ1减少与乳腺癌发病有关。大量研究证明RIZ1表达改变与RIZ1启动子区甲基化有关,故我们进一步观察了急性髓性白血病病人外周血标本中RIZ1基因表达及其甲基化状况,探讨RIZ1基因与急性髓性白血病的关系,以期RIZ1可成为其失活的急性髓性白血病病人有效的治疗靶点。

　　本研究发现,RIZ1基因在正常人外周血中均有表达,其mRNA相对含量平均值为0.79±0.12,而急性髓性白血病者为0.50±0.20,低于正常水平(P<0.05)。其中40.5%(15/37)的急性髓性白血病病人外周血标本RIZ1表达降低或缺失,表明RIZ1表达改变是急性髓性白血病的常见现象。

　　DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制,是调节基因组功能的重要手段,DNA甲基化转移酶(DNMT)以S腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到DNA上胞嘧啶5碳位置,形成CpG位点。在大多数哺乳动物中,DNA甲基化多位于基因CpG岛中[7]。启动子区CpG岛处于未甲基化状态的基因能正常表达,而其甲基化常导致基因表达沉默,尽管基因序列没有改变,这是多种肿瘤细胞中肿瘤抑制基因功能丧失的重要机制[8]。Akahira等[9]研究发现RIZ1表达下降与上皮性卵巢癌的发生、发展有关,认为这种表达改变的部分原因在于异常DNA甲基化。Piao等[10]也发现RIZ1启动子区甲基化引起该基因失活在肝癌发生特别是其早期阶段具有重要作用。本研究发现29.7%(11/37)的急性髓性白血病病人外周血标本存在RIZ1启动子区甲基化,并同时都存在RIZ1 mRNA表达下降或缺失,提示两者密切关联。在15例RIZ1基因表达降低或缺失的病人外周血标本中,4例未发现RIZ1基因启动子区甲基化,表明急性髓性白血病中RIZ1基因启动子区甲基化并不是表达改变的唯一原因,此时可能存在其他失活的机制。

　　在肿瘤中高频率出现的甲基化基因可以作为临床诊断、病程监控的分子标志物。肿瘤中DNA甲基化改变与临床表现具有潜在的关联,这种变化是微小转移的一个敏感指标,对预后判断具有一定价值。既然RIZ1基因的表达缺失与其DNA甲基化有关,那么修正基因的甲基化状态就有可能成为一新的肿瘤治疗途径。由于DNA甲基化现象是一种可逆性变化, 而该基因是组蛋白甲基转移酶家族成员之一,目前已经有人采用甲基化抑制剂5Azadc或其衍生物处理甲基化导致抑癌基因失活的肿瘤细胞,可使启动子区DNA去甲基化,恢复肿瘤细胞抑癌基因表达,使其去甲基化而被激活,在临床上已取得一定进展[11]。但DNA甲基化不是使其失活的唯一因素,应进一步研究如何增强RIZ1基因的有效表达及其他导致其沉默的机制,以期为急性髓性白血病的治疗提供新的前景。

　　【参考文献】

　　[1] 余卫平,方娟娟,DONG W F, 等. RIZ1表达对髓性白血病细胞株凋亡的影响[J].中国癌症杂志,2007,17(1)：6567.

　　[2] DU Y, CARLING T, FANG W, et al. Hypermethylation in human cancers of the RIZ1 tumor suppressor gene, a member of a histone/protein methyltransferase superfamily[J]. Cancer Res,2001,61(22)：80948099.

　　[3] STEELEPERKINGS G, FANG W, YANG X H, et al. Tumor formation and inactivation of RIZ1, an Rbbinding member of a nuclear proteinmethyltransferase superfamily [J]. Genes Dev,2001,15(17):22502262.

　　[4] OSHIMO Y, OUE N, MITANI Y, et al. Frequent loss of RUNX3 expression by promoter hypermethylation in gastric carcinoma[J]. Pathobiology,2004,71(3):137143.

　　[5] LAL G, SMITH B J, NICHOLSON R M, et al. RIZ1 is epigenetically inactivated by promoter hypermethylation in thyroid carcinoma[J]. Canner,2006,107(12):27522759.

　　[6] 方娟娟,余卫平,樊祥山,等. 乳腺癌中RIZ1的表达及其临床意义初探[J]. 现代医学,2006,34(2):113115.

　　[7] FELTUS F A, LEE E K, COSTELLO J F, et al. Predicting aberrant CpG island methylation[J]. Proc Nate Acad,2003,100(21):1225312258.

　　[8] NEPHEW K P, HUANG T H. Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression[J]. Cancer Lett,2003,190(2):125133.

　　[9] AKAHIRA J, SUZUKI F, SUZUKI T, et al. Decreased expression of RIZ1 and its clinicopathological significance in epithelial ovarian carcinoma: Correlation with epigenetic inactivation by aberrant DNA methylation [J]. Pathol Int,2007,57(11):725733.

　　[10] PIAO G H, PIAO W H, HE Y, et al. Hypermethylation of RIZ1 tumor suppressor gene is involved in the early tumorigenesis of hepatocellular carcinoma[J]. Histol Histopathol,2008,23(12):11711175.

　　[11] GHOSHAL K, BAI S. DNA methyltransferases as targets for cancer therapy[J]. Drugs Today(Barc),2007,43(6):395422.