热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克蛋白gp96表达的影响及其意义

　　作者：王昕,史斌,王申五,董建强,崔建英　　作者单位：首都医科大学附属复兴医院血液科，北京 100038; 1北京大学人民医院分子生物学教研室，北京 100014;基金项目：首都医学发展科研基金资助项目(086)

　　【摘要】本研究查明不同热应激条件对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中热休克蛋白gp96表达量的影响，为寻找增加K562细胞中gp96的提取量的最佳热应激条件提供实验依据。用免疫组织化学方法检测经38、40、42、44、46及48℃水浴热休克处理30分钟后的K562细胞中gp96表达量的变化;以平均阳性细胞百分率和平均荧光强度为指标，用流式细胞术研究40、44、48及52℃各水浴热休克处理30分钟对 K562细胞中gp96表达量的影响;利用免疫印记原理，用Western blot技术研究K562细胞经40、44、48与52℃水浴各休克处理30分钟后gp96表达量的变化。结果表明：免疫组织化学方法显示gp96主要在胞浆内表达，在48℃水浴热休克处理30分钟时，强阳性的细胞数最多，积分也最高;流式细胞术显示平均阳性细胞百分率和平均荧光强度均在48℃水浴热休克处理30分钟组达高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义;Western blot显示48℃水浴热休克处理30分钟时gp96的表达量达到高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义。结论： 48℃水浴热休克处理30分钟，gp96在K562细胞中的表达量达到高峰，该条件可作为提取K562细胞gp96的一个有效预处理条件。

　　【关键词】 慢性粒细胞白血病; 热休克蛋白; gp96; 肿瘤免疫; 热应激

　　Effect of Heat Stress on Expression of gp96 in K562 Cell Line of the Chronic Myeloid Leukemia and Its Significance　WANG Xin，SHI Bin，WANG Shen-Wu，DONG Jian-Qiang，CUI Jian-Ying，HAN Shu-Xia　Department of Hematology，Fuxing Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China; 1Department of Molecular Biology，People Hospital，Peking University，Beijing 100014，China

　　Abstracts This study was purposed to investigate the effect of different heat stress conditions on expression level of heat shock protein gp96 in K562 cell line of chronic myeloid leukemia in order to provide experiment basis for seeking optimal heat stress condition increasing extraction amount of gp96 from K562 cells. The expression changes of gp96 in K562 cell line was detected by immunocytochemistry under 38，40，42，44，46 and 48℃ for 30 minutes in water，by flow cytometry under 40，44，48 and 52℃ for 30 minutes in water，by Western blot under 40，44，48 and 52 ℃ for 30 minutes in water. Immunocytochemistry assay showed that gp96 existed mainly in cytoplasm. The peak of gp96 expression was at 30 minutes after 48℃ in water. The result of flow cytometry was consistent to immunocytochemitry detection results under temperatures 40，44，48 and 52℃ (P<0.01). Western blot showed that detection result was the same as the immunocytochemistry and flow cytometry detections. In conclusion，the expression of gp96 in K562 cell line reached peak at 30 minutes after 48℃ in water. This condition may be an effective preparative condition for extraction of gp96 from K562 cells.

　　Key words CML; heat shock protein; gp96; tumor immune; heat stress

　　热休克蛋白(heat shock protein，HSP)又称应激蛋白，具有高度保守性，高温及其它应激因素均能诱导其表达增加，它有多个家族。近年来的研究表明，热休克蛋白gp96参与机体的固有免疫和特异性免疫(也称适应性免疫)，能从两大途径引发机体的抗肿瘤免疫[1]，为慢性粒细胞白血病的生物治疗提供了新的思路。为满足进一步的基础和临床研究需求，需有大量的gp96，而现有的提取方法效率很低，很难满足研究需要。为此，本研究欲通过免疫组织化学、流式细胞术和Western blot技术，研究不同热应激条件对K562细胞中gp96表达量的影响，寻找出最佳热应激条件，为下一步增加提取gp96的量探索预处理条件，这是进一步研究慢性粒细胞白血病生物治疗的前提。

　　材料和方法

　　抗体及试剂

　　gp96大鼠单克隆抗体(大鼠抗人)为美国Neomar-kers公司产品，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大鼠IgG(二抗)及FITC标记的抗大鼠IgG(二抗)为美国KPL公司产品，均购自晶美公司。DAB试剂盒和封闭用的正常羊血清购自北京中山生物技术有限公司，Ttiton-X100 及Tween-20均为美国Sigma公司产品，RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司。溶血素、破膜剂、BSA及流式细胞仪均为Bection Dic-kinson公司产品。BCA蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司，预染的蛋白分子量标准购自Fermentas公司，混合发光试剂盒为Santa Cruz 公司产品，TEMED、SDS、PMSF、甘氨酸等均购自美国Sigma公司。

　　细胞系及培养条件

　　细胞系为慢性粒细胞白血病K562细胞系。K562细胞系由本实验室冻存，复苏后置于底面积为75 cm2的培养瓶内，加入RPMI 1640培养液及10%的胎牛血清，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，24-48小时传代1次。

　　gp96表达的免疫组织化学检测

　　检测方法

　　将K562细胞培养达对数生长期后，制备成细胞悬液，调整浓度至1×105/ml，等量分装后分别于38、40、42、44、46及48℃恒温水浴箱热休克处理30分钟后，各温度细胞用离心涂片机甩片，多聚甲醛室温固定后-20℃备用。将标本(各温度切片) 置于湿盒内(以下同)，用 3%的H2O2 37℃孵育30分钟，PBST漂洗3次;0.3%的Triton-X100 37℃孵育30分钟，PBST漂洗3次;用封闭血清于37℃封闭30分钟;弃血清后加1∶100的gp96大鼠单克隆抗体4℃过夜，PBST漂洗3次;加1∶150的HRP标记的抗大鼠IgG 37℃孵育30分钟，PBST漂洗3次;DAB显色。标本最后用苏木素染液复染2分钟，泡洗约2分钟、晾干，以中性树胶封片，照相。光学显微镜400倍下计数5-10个视野的细胞、阳性细胞占所计数细胞的比值为百分率。标本设阴性对照，即不加一抗，用PBS代替一抗，其余步骤同上。

　　评分标准

　　不同热应激条件下，根据K562细胞中棕黄色沉淀颜色深浅、所占胞浆面积的大小分为3个等级： ①浅棕色、所占胞浆面积1/2以下为弱阳性(+)，积分为1;②棕色、所占胞浆面积1/2-2/3为中阳性(++)，积分为2;③深棕色、所占胞浆面积2/3以上为强阳性(+++)，积分为3。计算不同温度下不同阳性等级的积分总和(百分率均值乘以积分等级)及所有阳性细胞的积分总和(各等级积分相加)。

　　gp96表达的流式细胞术检测

　　检测方法

　　收获对数生长期的K562细胞悬液，等量分装为4管，分别于40、44、48及52℃恒温水浴箱热休克处理30分钟，将每管的细胞悬液等分入A、B两管(流式上机管)，使细胞浓度为5×105/ml;A管为对照管，B管为实验管，各管加溶血素固定10分钟，离心后弃上清，再加破膜剂0.5 ml固定后离心弃上清，然后每B管加入1∶100的一抗37℃恒温孵育30分钟，各组A、B管再加入1∶100的FITC标记的二抗37℃孵育30分钟。然后取出各管，加入含1% BSA的PBS离心后弃上清，取0.5 ml的PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

　　评价标准

　　阳性细胞的百分率指表达gp96的细胞占所有细胞的百分率，反映表达gp96的细胞数量的多少;阳性细胞的平均荧光强度指单位细胞表达gp96的强度，反映每个细胞表达gp96的量。

　　gp96表达的Western blot检测

　　检测方法

　　收获对数生长期的K562细胞悬液，PBS洗3次后分别于40、44、48与52℃热休克处理30分钟，离心后加入5倍细胞沉淀体积的预冷的RIPA裂解液，旋涡震荡混合器充分混合后，冰上放置30分钟，超声粉碎机裂解后冰上再孵30分钟，离心后留取上清，-80℃保存备用。用BCA蛋白检测试剂盒测定样品浓度，制备SDS-PAGE凝胶(本实验使用12%的分离胶)，然后等蛋白总量上样、电泳、转膜、封闭过夜、杂交孵育抗体(一抗∶gp96稀释度1∶200，actin 1∶400; 二抗∶gp96稀释度1∶5 000，actin 1∶2 500;一抗室温孵育2小时，TBST洗3次，二抗室温孵育1小时，TBST洗3次)，最后暗室中用混合发光试剂显影在胶片上，根据发光强度调整曝光时间。

　　评价标准

　　凝胶成像软件分析胶片上条带的灰密度积分，用gp96条带的灰度积分除以相应泳道的actin的灰度积分，二者的比值最高表示该组刺激条件下gp96的表达量最高。

　　统计学处理

　　数据用SPSS 10.0医用统计学软件处理。所有数据进行正态检验和方差齐性检验，复合正态、方差齐的进行单因素方差分析，差异有意义时组间差异(两两比较)采用Q检验;方差不齐时，采用秩和检验，差异有意义时进行两两比较。数据以均数±标准差(X±SD)、平均秩次来表示。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有非常显著的统计学意义。

　　结 果

　　K562中gp96表达的组织化学检测结果

　　在48℃水浴30分钟这一热应激条件下，gp96强阳性细胞(+++)的百分率均值为35%，积分总和为105，所有阳性细胞(+，++，+++)的积分总和为202，均在各组中最高。在38-48℃之间不同刺激条件下，K562中gp96的表达量有所变化，在48℃组表达量最高(图1，表1)。Table 1. Mean percentage and integral of positive gp96 cells under different heat stress in K562 cell line (略)

　　K562中gp96表达的流式细胞术检测结果

　　阳性细胞的百分率

　　各组阳性细胞的百分率资料方差不齐，实验结果经秩和检验法统计处理。百分率随着温度的变化而变化，在40℃-52℃之间逐渐增高，平均秩次分别为6.00，18.80，30.08，26.40，总的来说各温度之间的P=0.000，<0.01，差异有非常显著的统计学意义。组间两两比较，40与44℃ P=0.001，40与48℃ P=0.000，40与52℃之间P=0.000，P“均<0.01，差异有非常显著的统计学意义;44与48℃之间P=0.002，<0.01，差异有非常显著的统计学意义，但与52℃之间P=0.096，>0.05，差异无统计学意义;48与52℃之间P=0.326，>0.05，差异无统计学意义。由于48与52℃组间差异无统计学意义，可以说48℃水浴30分钟K562中表达gp96的阳性细胞百分率最高，该组刺激条件可以作为提取gp96的有效预处理条件(图2，表2)。Table 2. Mean rank of positive gp96 cell percentage in K562 under different heat stress(略)

　　阳性细胞平均荧光强度

　　各组阳性细胞平均荧光强度的资料符合正态分布，方差齐，实验结果经单因素方差分析法统计处理。40℃组均数为26.146，44℃组均数为28.493，48℃组均数为41.568，52℃组均数为39.186，各温度之间的P=0.000，<0.01，差异有非常显著的统计学意义。组间两两比较，40与44℃间P=0.973，40与52℃之间P=0.051，P值均>0.05，差异无统计学意义，但与48℃间P=0001，<0.01，差异有非常显著的统计学意义;44与48℃之间P=0.009，<0.01，差异有非常显著的统计学意义，但与52℃之间P=0.160，>0.05，差异无统计学意义;48与52℃之间P=0.996，>0.05，差异无统计学意义。由于48与52℃组间差异无统计学意义，可以说48℃水浴30分钟K562细胞中表达gp96的阳性细胞平均荧光强度最高，该组刺激条件可以作为提取gp96的有效预处理条件(图2，表3)。Table 3. Mean fluorescence intensity of positive gp96 cells in K562 under different heat stress (略)

　　K562中gp96表达的Western blot检测结果

　　Gp96条带的灰度积分除以相应Actin的灰度积分的比值资料符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。比值均数：40℃组为0.806，44℃组为0.830，48℃组为1.571，52℃组为2.064，总的来说各温度之间的 P=0.000，<0.01，差异有非常显著的统计学意义。组间两两比较，40与44℃间P=0.938，>0.05，差异无统计学意义，但与48℃间 P=0.016，与52℃之间P=0.000，P均<0.01，差异有非常显著的统计学意义;44与48℃之间P=0.019，与52℃之间P=0.000，P均<0.05，差异有显著的统计学意义; 48与52℃之间P=0.107，>0.05，差异无统计学意义。由于48与52℃组间差异无统计学意义，可以说48℃水浴30分钟K562中gp96的表达量最高，该组刺激条件下96的表达量最高，可以作为提取gp96的有效预处理条件(图3，表4)。Table 4. Ratio of gp96 to actin in K562 cells under different heat stress (略)

　　讨 论

　　热休克蛋(HSP)是一个具有不同分子量和细胞内定位的大家族蛋白质，在进化中高度保守。热休克蛋白gp96是HSP-90家族的一个成员，主要存在于细胞浆的内质网。目前，在免疫学中gp96介导的肿瘤排斥机制的研究表明：它以两种方式参与机体的固有免疫和特异性免疫(也称适应性免疫)，能从两大途径引发机体的抗肿瘤免疫。[1，2，3]。在很多动物肿瘤模型如肝癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌等中，均已证实HSP的预防和治疗作用;近年来，从人类黑色素瘤和结肠癌中纯化的gp96已被证实，它能够将抗原肽呈递给CD8+的T细胞，在体内外的实验中均能激活该T细胞，引发抗原特异的免疫应答[4]。基于以上基础和临床研究，我们尝试为慢性粒细胞白血病的免疫治疗寻找一种新的方法，但是进一步的研究的前提是需要大量的gp96。要解决这一问题，可以从两方面入手：第一，在提取gp96前，对提取物进行预处理，增加gp96的表达量;第二，改进现有的提取方法来增加提取量。对于提取方法，近年来，Arnold-Schild等[5]提出了一种新的提取方法，其基础是热疗。近年来，热疗的生物学进展使肿瘤热疗成为肿瘤综合治疗的手段之一，主要原因在于热疗不仅能够引起细胞质膜的整体损伤和结构破坏[6]，而且热疗本身能增强T淋巴细胞、B淋巴细胞以及NK细胞的抗肿瘤活性，从而增强机体免疫监视功能[7]，同时在热疗时产生的热休克蛋白可全面激活机体的免疫系统。HSP-肽复合物在热疗中产生，经MHC-I类分子及巨嗜细胞的加工能为CTL细胞识别而产生特异性免疫[8，9]，从而对体内同时存在的肿瘤细胞起到强烈的杀伤作用。现有的研究表明，热休克蛋白gp96在热休克，糖饥饿及应激因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素α和γ(INF-α和INF-γ)、2-巯基乙醇等应激条件下表达均增加[10]。基于以上研究成果，我们选择了热应激作为提取gp96的预处理条件。国外Maki等人用Nor-thern blot法曾在RNA水平上研究过热应激对gp96表达量的影响，他们报道42℃，1小时热休克处理后gp96的表达量比处理前增加，然而比较系统地研究热应激对gp96表达量影响的工作，目前国内外尚未见报道。

　　本实验选用免疫组织化学、免疫荧光和免疫印记3种方法研究热应激对gp96表达量的影响。免疫组织化学方法从形态学上，直观地记录了不同热应激条件下，gp96表达量的变化，发现从38℃-48℃之间，gp96的表达量有着明显的变化，在48℃时强阳性细胞数最多，积分也最高，说明在这一热应激范围内，即gp96在48℃，30分钟这一热应激条件下表达最高。为了验证这一趋势，我们设计了第二种方法，通过流式细胞术，利用免疫荧光的原理，观察阳性细胞百分率和平均荧光强度，经过统计学分析，gp96的表达量在48℃组达高峰，这一结果与第一部分的结果是吻合的。为了验证这一结果，利用免疫印记原理，通过Western blot方法检测，结果与第一部分和第二部分一致。由于48与52℃组间差异无统计学意义，且52℃组镜下细胞几乎全部死亡，为了尽可能多地得到gp96的同时尽可能地保留其免疫活性，没有再设计更高的温度。本研究3种方法都得出了一个共同的结论：在48℃，水浴30分钟这一热应激条件下，gp96的表达量达高峰，该条件可作为提取K562细胞的gp96一个有效预处理条件，这为将来gp96与慢性粒细胞白血病免疫治疗的进一步研究提供了实验依据。

　　【参考文献】

　　1 Baker-LePain JC，Reed RC，Nicchitta CV. ISO: a critical evaluation of the role of peptides in heat shock/chaperone protein-mediated tumor rejection. Curr Opin Immunol，2003; 15:89-94

　　2 Hilf N，Singh-Jasuja H，Schild H，et al. The heat shock protein Gp96 links innate and specific immunity. Int J Hyperthermia，2002; 18：521-533

　　3 Robert J，Cohen N，Maniero GD，et al. Evolution of the immunomodulatory role of the heat shock protein gp96. Cell Mol Biol(Noisy-le-grand) . 2003; 49:263-275

　　4 Mazzaferro V，Coppa J，Carrabba MG，et al. Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res，2003; 9:3235-3245

　　5 Arnold-Schild D，Kleist C，Welschof M，et al. One-step single-chain Fv recombinant antibody-based purification of gp96 for vaccine development. Cancer Res，2000; 8：4175-4178

　　6 李鼎九，胡自省，钟毓斌主编. 肿瘤热疗学. 郑州：郑州大学出版社，第二版. 2003:141-142

　　7 Manjili MH，Wang XY，Park J，et al. Immunotherapy of cancer using heat shock proteins. Front Biosci，2002; 7:43-52

　　8 Srivastava PK，Amato RJ. Heat shock proteins: the ‘Swiss Army Knife’ vaccines against cancers and infectious agents. Vaccine，2001; 19:2590-2597

　　9 Sawaji Y，Sato T，Seiki M，et al. Heat shock-mediated transient increase in intracellular 3’，5’-cyclic AMP results in tumor specific suppression of membrane type 1-matrix metalloproteinase production and progelatinase A activation. Clin Exp Metastasis，2000; 18:131-138

　　10 Heike M，Frenzel C，Meier D，et al. Expression of stress protein gp96，a tumor rejection antigen in human colorectal cancer. Int J Cancer，2000; 86:489-493.