川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响

　　作者：吴宁,周登锋,齐洁琳,张锡芹,步兵　　作者单位：山东省肿瘤防治研究院内一科， 济南 250117; 1华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科， 武汉 430030;基金项目:国家自然科学基金资助，编号 No.39870926

　　【摘要】本研究探讨川芎嗪对骨髓移植(BMT)后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响及其促进骨髓造血重建的机制。取健康BALB/c小鼠，随机分为3组：正常组(不做处理)，BMT+生理盐水组(简称生理盐水组)和BMT +川芎嗪治疗组(简称川芎嗪组)。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0.2毫升/只和川芎嗪注射液每次2毫克/只，2次/天，直至处死为止。在BMT后第7、14、21、28天处死小鼠，用RT-PCR和Western blot方法检测骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白表达水平。结果表明： BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白的表达均明显低于正常组(P<0.01或P<0.05)，但川芎嗪组明显高于生理盐水组(P<0.01或P<0.05)，到第28天，川芎嗪组bFGF mRNA及其蛋白的表达已恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异(P<0.01)。结论：川芎嗪可能通过增加bFGF的表达水平而促进骨髓微环境的修复，加速BMT后骨髓的造血重建。

　　【关键词】 川芎嗪; 骨髓移植; 骨髓基质细胞; 碱性成纤维细胞生长因子

　　Effect of Ligustrazine on the Expression of bFGF in bone marrow stromal cells of mice after BMT　WU Ning, ZHOU Deng-Feng, QI Jie-Lin, ZHANG Xi-Qin, BU Bing, LIU Pu-Xia, WANG Ming-Yu, SUN Han-Ying, LIU Wei-Li　Department of Radiation Oncology, Shandong Tumor Hospital and Institute of Oncology, Jinan 250117, China; 1Department of Hematology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

　　AbstractThis study was purposed to investigate the effect of ligustrazine on the expression of bFGF in bone marrow stromal cells (BMSC) and to explore the mechanism of hematopoietic reconstitution after bone marrow transplantation (BMT). The mice were randomly divided into 3 groups： normal group,saline group and ligustrazine group. BMT mouse models were established. The mice of normal group were not treated, the mice of saline group were given normal saline (0.2 ml/mouse, twice a day) through gastric tube, while the mice of ligustrazine group were given ligustrazine (0.2 ml/mouse, twice a day) through gastric tube. On day 7, 14, 21 and 28 after BMT, the femora were taken and the bone marrow mononuclear cell (BMMNC) suspensions were used for the cultivation of bone marrow stromal cells according to Dexter's culture method. The mRNA and protein expressions of bFGF in BMSC were assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed that the expression of bFGF in BMSC on the level of mRNA and protein were all reduced significantly after BMT, and increased slowly with the time. On day 7,14 and 21 after BMT, the expressions of bFGF mRNA and protein in bone marrow stromal cells of ligustrazine group and saline group were lower than that in bone marrow stromal cells of normal group, but the expressions of bFGF mRNA and protein in ligustrazine group were obvionsly higher than that in saline group (P<0.01 or P<0.05). On day 28 after BMT, the expressions of bFGF mRNA and protein in ligustrazine group returned to normal level, while the expressions of bFGF mRNA and protin in saline group not returned to normal level, there was significant difference between these two groups. It is concluded that ligustrazine can enhance bFGF expression level in bone marrow stromal cells after syngeneic bone marrow transplatation in mice, which confirms that ligustrazine can enhance the repair of bone marrow microvessels, improve bone marrow microenvironment and promote hematopoietic reconstitution.

　　Key wordsligustrazine; bone marrow transplantation; bone marrow stromal cell; bFGF

　　造血干细胞(HSC)移植是目前治疗多种难治性血液病主要手段之一。受者在BMT前需要接受大剂量的放疗、化疗。骨髓是对辐射敏感的器官之一。射线不仅杀伤骨髓中的造血细胞，而且对骨髓微环境中的基质细胞及其分泌的生长因子也有特异性的影响[1]。以往我们的研究表明，川芎嗪通过促进骨髓微血管系统修复、增加骨髓微环境供氧、改善骨髓微环境，并促进骨髓基质细胞生长及其黏附能力，促进造血干细胞增殖[2]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种多功能的细胞因子，与其特异性受体(bFGFR)结合后刺激内皮细胞增殖、移行，促进血管新生，为一种血管新生诱导因子。本试验通过观察川芎嗪对骨髓移植(BMT)后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达的影响，进一步探讨川芎嗪促进BMT小鼠造血重建的作用机制。

　　材料和方法

　　实验动物

　　清洁级近交系BALB/c小鼠(H-2d， MLSb)，8-10周龄，18-22克，雌雄兼用(湖北省实验动物中心提供)。每只小鼠于照射前3天到照射后14天喂饲庆大霉素水(200 U/day)清洁肠道。

　　药物

　　盐酸川芎嗪注射液20 g/L(无锡市第七制药厂产品，批号030822)。

　　试剂和仪器

　　兔抗小鼠bFGF、bFGFR单克隆抗体(Santa Cruz Biotechology公司提供);NBT/BCIP染色试剂盒(武汉中健公司产品)，PCR引物(上海生物工程公司合成);TRIZOL、PCR kit、DL2000 Marker(TaKaRa公司产品);DEPC、RNase A酶、PI(Promega公司产品);FITC-山羊抗兔 IgM单克隆抗体(北京中山公司产品);流式细胞仪(Becton Dickinson产品)。

　　分组及处理

　　BALB/c小鼠72只，随机分为3组。正常组8只(未作任何处理);BMT+生理盐水组(以下简称生理盐水组)及BMT+川芎嗪组(以下简称川芎嗪组)各32只。移植前4小时小鼠均经60Co γ线全身均匀照射，总剂量7.5 Gy，剂量率为1.644 Gy/min。BMT模型的建立[3]：取正常的BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死后立即取双侧股骨制备单个核细胞悬液并计数，调整细胞浓度至1×107/ml，4小时内经尾静脉注入受照射的生理盐水组及川芎嗪组小鼠体内(供体鼠和受体鼠比例为1∶4)，注入细胞数为2×106/只，液体量0.2毫升/只。制成BMT模型后，川芎嗪组小鼠立即喂饲盐酸川芎嗪注射液2毫克/只，每天2次;生理盐水组喂饲生理盐水，0.2毫升/只，每天2次。以上两组均用药至处死为止。

　　骨髓有核细胞计数(BMNC)

　　于BMT后7，14，21，28天颈椎脱臼法处死小鼠，称重，浸入75%乙醇中3分钟，然后取双侧股骨，用RPMI 1640从骨髓腔冲出有核细胞，按白细胞计数方法，计数有核细胞。

　　骨髓基质细胞培养

　　分别于BMT后7、14、21、28天处死小鼠，参照Dexter方法[4]进行骨髓基质细胞培养。每周半量换液1次，至贴壁细胞长满为止(14-21天)。

　　骨髓基质细胞bFGF蛋白表达的Western blot分析

　　参照分子克隆实验南[5]进行。 分离、收集BMNC后，加入5倍体积的细胞裂解液并混匀，冰上裂解20分钟，离心吸上清即为细胞总蛋白。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移按照说明书进行。兔抗小鼠bFGF单克隆抗体(1∶500稀释)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG单克隆抗体(1∶4 000稀释二抗)，37℃孵育1小时，用PBS洗膜，NBT/BCIP显色。对Western blot的特异性条带进行灰度扫描，以积分光密度×面积(mm2)表示条带的信号强弱，以此对目的蛋白表达水平进行半定量比较。数据以各组条带积分光密度×面积/未处理组条带积分光密度×面积表示。

　　骨髓基质细胞bFGF mRNA水平表达的RT-PCR检测

　　参照分子克隆实验指南[5]进行。采用GeneFisher1.3软件设计引物序列：bFGF上游引物：5'-GGAGAAGAGCGACCCACACG-3'，下游引物：5'-GCAGACATTGGAAGAAACAG-3'。β-actin 上游引物：5'-GGACCTCTGAGAGCTTCACGCCCAGTGA-3'，下游引物：5'-GCCAGAGAATGTTGCTGAGGAGGTGGGG-3'。用TRIZOL试剂盒，按说明提取骨髓基质细胞总RNA并测定纯度。93℃预变性1分钟，93℃变性30秒，72℃延伸60秒。bFGF 56℃退火30秒，共35个循环，循环后72℃延伸8分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统对DNA条带扫描，以目的基因扫描密度值/β-actin基因扫描密度值的百分数(%)作为目的基因mRNA的相对表达量。bFGF扩增产物大小为288 bp，β-actin为400 bp。

　　统计学分析

　　数据以均数±标准差 ( ±SD) 表示，采用 SAS 10.0统计软件进行t检验。

　　结果

　　骨髓基质细胞bFGF蛋白表达水平分析

　　BMT后第7至21天，川芎嗪组和生理盐水组bFGF蛋白表达水平均明显低于正常组(P<0.05或P<0.01)，但川芎嗪组明显高于生理盐水组(P<0.05或P<0.01);到BMT后第28天川芎嗪组已基本恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异(P<0.01)(图1、2)。

　　骨髓基质细胞bFGF mRNA表达水平分析

　　分别于BMT后第7、14、21、28天取BMNC培养骨髓基质细胞，待其长满培养孔底时提取RNA进行RT-PCR分析。图3、4为RT-PCR产物电泳结果(扩增产物为288 bp小鼠bFGF特异条带，内参照大小为400 bp)。BMT后7至21天川芎嗪组和生理盐水组小鼠骨髓基质细胞bFGF mRNA表达显著下降，随着时间延长川芎嗪组在第28天已恢复正常水平，但生理盐水组仍明显低于正常(P<0.05或 P<001)(图5)。

　　讨论

　　骨髓造血微环境在结构上分为基质细胞和细胞外基质，其中骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSC)是骨髓造血微环境的核心，它通过与造血细胞密切接触，可以持续稳定地分泌多种细胞因子(包括正、负造血调控因子)调节造血，其结构和功能的完整性对于保护机体造血的稳定性具有十分重要的作用。骨髓是对辐射敏感的器官之一，γ射线在损伤造血细胞的同时对骨髓微环境也有一定程度的损伤，而损伤后骨髓造血功能的恢复必须先有血管系统特别是静脉窦的修复和血流的重建，以保护细胞成长所需要的营养物质和体液因子，促进造血细胞、基质细胞的生长发育及其功能。bFGF既是一种高度特异的内皮细胞丝裂原，又是血管生成素、细胞生长因子[6]，具有多种功能，且与细胞迁移、分化及组织发育有关。血管内皮细胞、成纤维细胞、T、B淋巴细胞、巨核细胞、血小板等为其特异性靶细胞。bFGF通过与靶细胞表面特异性受体(bFGFR)结合刺激内皮细胞增殖、移行，增加血管通透性，调节血管新生及血管形成。在以往的研究中，我们实验小组已经证实,川芎嗪可以明显减少骨髓移植早期骨髓内基质出血，改善骨髓微环境供氧，加快早期骨髓血管网络修复，促进造血微环境的恢复[7]。川芎嗪还能上调骨髓基质细胞FAK、SCF、VEGF的表达[8,9]，促进骨髓基质细胞增殖，调控造血过程，并可以促进骨髓组织中HS、CD44、CD31、ICAM-1的表达[10-13]，后者参与介导造血干细胞黏附定居和增殖分化，能够加快骨髓移植后的造血重建。在实验中我们观察到： ①bFGF在BMT后不同时间点小鼠骨髓基质细胞中有不同程度的表达。表明基质细胞可产生分泌bFGF。②BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组小鼠骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白的表达水平均低于正常组，随着造血的恢复其表达逐渐增高，说明骨髓造血微环境受损影响骨髓基质细胞分泌细胞因子。③BMT后第7、14、21、28天川芎嗪组骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白的表达水平均高于同一时间点生理盐水组，提示川芎嗪可增强骨髓基质细胞bFGF的表达。由此，我们推断，川芎嗪通过增强放射损伤小鼠骨髓基质细胞碱性成纤维细胞生长因子bFGF的表达，促进造血微环境中微血管和静脉窦的修复和血流的重建，为造血细胞和基质细胞的增殖分化提供了所必需的氧、营养物质及体液因子，促进了骨髓造血。

　　【参考文献】

　　1 Greenberger JS, Anderson J, Berry LA,et al. Effects of irradiation of CBA/CA mice on hematopoietic stem cells and stromal cells in long-term bone marrow cultures. Leukemia,1996;10:514-527

　　2 孙汉英，舒砚君，刘文励等. 川芎嗪改善免疫诱导再障小鼠骨髓微环境的作用研究. 中华血液学杂志，1998; 19：178-180

　　3 林治栋. 骨髓基质细胞及其辐射残留损伤. 国外医学•放射医学核医学分册，2001; 25：282-284

　　4 Dexter TM, Moore MA, Sheridan AP. Maintenance of hematopoietic stem cells and production of differentiated progeny in allogeneic and semiallogeneic bone marrow chimeras in vitro. J Exp Med, 1977; 145:1612-1616

　　5 Katoh O, Takahashi T, Oguri T, et al. Vascular endothelial growth factor inhibits apoptotic death in hematopoietic cells after exposure to chemotherapeutic drugs by inducing MCL1 acting as an antiapoptotic factor. Cancer Res, 1998; 58:5565-5569

　　6 熊盛，林剑，姚汝华等. 碱性成纤维细胞生长因子与肝素结合性质的研究进展. 中国病理生理杂志，2002; 18：214-217

　　7 周银莉，刘文励，孙汉英等. 川芎嗪对骨髓移植小鼠早期造血重建的作用研究. 中华血液学杂志，2002;23：207-208

　　8 孙岚，刘文励，孙汉英等. 川芎嗪对放射损伤小鼠骨髓基质细胞FAK表达的影响. 中国中西医结合急救杂志，2001; 8：226-227

　　9 何丽，孙汉英，刘文励等. 川芎嗪对同基因骨髓移植小鼠骨髓中干细胞因子表达的影响. 中国血液流变学杂志，2004; 14：9-12

　　10 任天华，刘文励，孙汉英等. 川芎嗪对骨髓移植小鼠骨髓中硫酸肝素表达水平的影响. 中华血液学杂志，2001; 22：270-271

　　11 罗琳，刘文励，孙汉英等. 川芎嗪对骨髓移植后小鼠CD44表达的影响. 中国实验血液学杂志，2004; 12：278-281

　　12 刘丹，孙汉英，刘文励等. 川芎嗪对同基因骨髓移植小鼠骨髓细胞PECAM-1/CD31分子表达与造血重建的作用. 中国实验血液学杂志，2004; 12：489-493

　　13 付丽，刘文励，孙汉英等. 川芎嗪对骨髓移植后小鼠LAF-1和ICAM-1表达的影响. 中国实验血液学杂志，2004; 12：174-178.