rhG-CSF动员对供者血浆S1P浓度的影响

　　作者：黄文荣,王立生,段海峰,高春记　　作者单位：解放军总医院血液科，北京100853; 1军事医学科学院放射医学研究所，北京

　　【摘要】1-磷酸鞘氨醇(S1P)是具有广泛生物学效应的磷脂代谢产物，多种生长因子均能通过影响细胞鞘氨醇激酶(SphK)活性而调节S1P的生成，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是一种广泛用于外周血造血干细胞动员的一种细胞因子。本研究主要了解rhG-CSF动员对供者血浆S1P含量的影响。分离供者rhG-CSF动员前和动员第5天外周血单个核细胞和血浆，用RT-PCR检测动员前后单个核细胞SphK mRNA表达情况，并应用γ-32P-ATP掺入法和SphK酶促反应检测动员前后血浆S1P变化。结果表明，供者动员前后外周血单个核细胞均表达SphK mRNA;在rhG-CSF动员前后供者血浆中均含有S1P，且S1P浓度在rhG-CSF动员前和动员后第5天无明显变化(P>005)。结论： rhG-CSF动员对供者血浆S1P含量无明显影响。

　　【关键词】 重组人粒细胞集落刺激因子;外周血动员;血浆;1-鞘氨醇激酶

　　Impact of rhG-CSF on Sphingosine 1-phosphase Concentration in Blood Plasma of Donors　HUANG Wen-Rong，WANG Li-Sheng，DUAN Hai-Feng，GAO Chun-Ji，LU Zhuo-Zhuang，WANG Hua，DA Wan-Ming　Department of Hematology，General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100853，China; 1Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China

　　Abstract Sphingosine 1-phosphate (S1P)，which can be impacted by different growth factors through sphingosine kinase (SphK)，is a bioactive lipid produced by metabolism of sphingolipid with various biological responses. Recombinant human granulocyte-colony-stimulating factor(rhG-CSF) have been used widely in peripheral blood stem/progenitor cell mobilization. This study was aimed to investigate the effects of rhG-CSF on S1P concentration in plasma of donors. The peripheral blood mononuclear cells and blood plasma were collected from 8 peripheral blood progenitor cell donors before mobilization and on the fifth day of mobilization with rhG-CSF. The SphK mRNA expression of blood mononuclear cells were detected by RT-PCR. The changes of S1P concentration were assayed with SphK enzyme catalyzed reaction. The results showed that both kinds blood mononuclear cells collected before and after rhG-CSF mobilization expressed SphK mRNA. The S1P concentration is low in donor’s plasma both before and after mobilization with rhG-CSF，and there was no markedly change of S1P concentration in plasma before and after mobilization(P>0.05). In conclusion，mobilization with rhG-CSF does not impact S1P concentration in donors’ plasma.

　　Key words rhG-CSF peripheral blood; Mobilization; plasma; sphingosine 1-phosphate

　　体内1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphase，S1P)主要来源于细胞膜鞘磷脂的分解代谢，参与S1P生物合成调节的关键限速酶为鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SphK)[1]。人外周血小板、红细胞、中性粒细胞和单个核细胞中都有SphK [2]，多种生长因子均能影响细胞SphK活性而调节S1P的生成，生成的S1P具有广泛的生物学效应[3]。重组人粒细胞集落刺激生长因子(rhG-CSF)是一种最常用的动员外周血造血干/祖细胞的生长因子[4]，本研究旨在了解rhG-CSF动员是否会引起血浆S1P变化，从而初步判断rhG-CSF动员产生的系列生物学效应是否在一定程度上与S1P介导的通路有关。

　　材料和方法

　　供者

　　正常造血干细胞供者8例。

　　动员方案

　　造血干细胞动员方案为正常供者在全面查体完毕后给予rhG-CSF(Kirin公司产品)10 μg/(kg•d)进行动员，连续7天。

　　血浆和单个核细胞的分离获取

　　在动员前和动员后第5天采集供者外周血5 ml，500×g离心30分钟以沉淀红细胞、白细胞和血小板，吸取的上清即为所需要的血浆;将沉淀的细胞使用PBS溶液稀释后常规分离出单个核细胞备用。

　　单个核细胞SphK mRNA表达的RT-PCR检测

　　取分离获得的单个核细胞1×106，应用TRIZOL (Invitrogen公司产品)一步法提取细胞总RNA，取2 μg RNA逆转录合成cDNA第一链后行PCR扩增SphK片段。SphK的上游引物5’-ATGCACGAGGTGGTGAACG-3’，下游引物5’-GGAGGCAGGTGTCTTGGAAC-3’，扩增产物426 bp。PCR反应条件： 96℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环后72℃延伸10分钟，取产物10 μl在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，分离检测SphK mRNA。

　　重组SphK激酶的制备

　　用含野生型SphK基因的质粒转染ECV304细胞(转染采用脂质体2000转染试剂)，随后用G418进行筛选和扩增培养，4℃离心收集细胞并以冰预冷PBS洗涤细胞3次，然后在冰上向细胞加入缓冲液A(20 mmol/L Tris，20%甘油，15 mmol/L NaF，1 mmol/L EDTA，40 mmol/L β-甘油磷酸，1 mmol/L原矾酸钠，1 mmol/L β-巯基乙醇，1 μg/ml leupeptin，100 μg/ml PMSF)，-70℃冻融3次以充分裂解细胞;4℃，14 000×g离心30分钟，收集的上清即为胞浆中重组SphK激酶蛋白液并进行酶活性分析。将酶活性良好的蛋白液分装于-80℃保存。

　　细胞SphK活性的γ-32P-ATP掺入法检测[5]

　　首先对ECV304细胞转染SphK基因前后的蛋白提取上清进行定量(BCA-200蛋白检测试剂盒，Pierce公司产品)，根据蛋白定量取SphK基因转染前后ECV304细胞的蛋白，提取上清并使蛋白含量相同，补加裂解液A使样品体积均为45 μl;加入1 mmol/L鞘氨醇(Sigma公司产品)2.5 μl混匀;加入2.5 μl γ-32P-ATP(10 μlCi，20 mmol/L)，37℃反应30分钟;加入5 μl 1mol/L HCl和0.2 ml终止液(氯仿/甲醇/浓盐酸=100∶200∶1)，进行猛烈振荡，然后终止反应;加入60 μl氯仿和60 μl 2 mol/L KCl萃取S1P，12 000×g离心5分钟;弃水相，取30 μl有机相点样于硅胶Gel 60层析板(Merck公司产品)，在展开液(丁醇/乙醇/乙酸/水=80∶20∶10∶20)中进行薄层层析45分钟;行放射自显影，分析SphK酶活性。

　　血浆S1P提取和去磷酸[6]

　　取血浆1 ml，依次加入1 ml含2.5 μl浓盐酸的甲醇、1 ml氯仿和100 μl 3 mol/L NaOH溶液，300×g离心5分钟，收集碱性水相于硅化的玻璃管中，有机相再用0.5 ml氯仿、0.5 ml 1 mol/L NaCl和50 μl 3 mol/L NaOH溶液抽提1次，并将含S1P的碱性水相收集于硅化的玻璃管中。取2次收集的碱性水相1 ml，加入消化缓冲液[200 mmol/L Tris (pH 7.4);75 mmol/L MgCl2;2 mmol/L 甘氨酸(pH 9.0)]150 μl和20 U牛小肠碱性磷酸酶，37℃孵育30分钟以使S1P去磷酸化为鞘氨醇。加入17 μl浓盐酸混匀终止反应。分别用0.5 ml氯仿抽提2次，收集2次抽提的含鞘氨醇的有机相于小烧杯中;超净台吹风干燥，重悬沉淀于100 μl含0.25%Triton X-100的缓冲液A中以备行SphK酶促反应。

　　血浆S1P含量的SphK酶促反应检测

　　反应体系组成： 35 μl血浆鞘氨醇抽提样品+2.5 μl γ-32P-ATP(5 μCi，20 mmol/L)，再加入7.5 μl重组SphK激酶提取液，37℃反应30分钟;加入5 μl 1 mol/L HCl和0.2 ml终止液(氯仿/甲醇/浓盐酸=100∶200∶1)，猛烈振荡，终止反应;加入60 μl氯仿和60 μl 2 mol/L KCl萃取S1P，12 000×g离心5分钟，弃水相，取30 μl有机相点样于硅胶Gel 60层析板，在展开液(丁醇/乙醇/乙酸/水=80∶20∶10∶20)中进行薄层层析45分钟;然后进行放射自显影和图像分析S1P含量。

　　结 果

　　rhG-CSF动员前后外周血单个核细胞SphK的表达

　　图1为RT-PCR检测动员前后供者外周血单个核细胞SphK mRNA的表达情况，第1泳道为动员前单个核细胞SphK mRNA的表达，第二泳道为动员后单个核细胞SphK mRNA的表达。由此可见，造血干细胞供者在rhG-CSF动员前后的外周血单个核细胞均有SphK mRNA表达。

　　ECV304细胞转染SphK基因前后SphK激酶活性检测

　　图2为ECV304细胞转染SphK基因前后提取细胞胞浆蛋白行SphK激酶活性检测的放射自显影结果，ECV304细胞转染SphK基因后的SphK活性比转染前显著增加近100倍(P<0.05)，这说明SphK基因转染成功并表达有活性的SphK蛋白。

　　rhG-CSF动员前后血浆S1P浓度的变化

　　对碱性抽提rhG-CSF动员前后供者血浆S1P的SphK酶促反应和放射自显影图像分析后发现，在rhG-CSF动员前后供者血浆中均含有S1P，且S1P浓度在rhG-CSF动员前和动员后第5天无明显变化(P>0.05)，图3为1例供者在rhG-CSF动员前后的血浆S1P浓度检测的放射自显影图。

　　讨论

　　虽然S1P具有刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡、增加细胞内钙离子浓度、抑制细胞迁移、诱导应急纤维形成、调节黏附分子表达和调节细胞的形态分化等广泛的生物学效应[1，3]，但国内尚无人体组织液包括血浆中S1P含量测定的相关文献报道。由于S1P在碱性条件下溶于水，而鞘氨醇等其它鞘磷脂则不溶于水，因而通过碱性分离血浆水相和有机相可以在水相中获得90%以上的血浆S1P，进一步在牛小肠碱性磷酸酶的作用下可以使85%以上的S1P通过脱磷酸化转变为鞘氨醇，然后将抽提的鞘氨醇在SphK的作用下通过酶促反应再重新转换成S1P，进一步抽提S1P并通过层析和放射自显影后分析S1P量的变化，这样就可以间接测定血浆S1P含量[6]。本研究根据国外的文献报道成功地建立了通过SphK酶促反应测定血浆S1P含量的方法，该方法也可用于其它组织液、细胞培养液等液体中S1P含量的检测。

　　由于人外周多种血细胞都有较高活性SphK，而S1P裂解酶活性较低，且血浆中S1P能与血浆白蛋白结合存在，故人血浆中S1P的浓度通常维持在微摩尔水平[2]。在免疫调节方面，S1P能抑制T细胞增殖和凋亡，诱导T细胞向Th2细胞分化，改变细胞因子分泌，调节T细胞趋化迁移及影响DC细胞功能等[7]。生长因子、血小板衍生的生长因子、内皮细胞生长因子、神经生长因子等多种细胞因子均会激活鞘氨醇激酶，引起S1P合成增加 [3]。rhG-CSF是异基因外周血造血干/祖细胞动员最常用的细胞因子，而且能使Th细胞向Th2的极化和Tc细胞向Tc2的极化，并使T细胞增殖能力和细胞毒性下降[8]。虽然S1P和rhG-CSF动员对T细胞的免疫调节具有相似的作用，本研究也证实rhG-CSF动员前后的外周血单个核细胞均有SphK表达，但动员没有引起血浆S1P水平发生明显变化，因此rhG-CSF动员对T细胞的影响可能与血浆S1P浓度的变化没有直接关系。

　　【参考文献】

　　1 Spiegel S，Milstien S. Sphingosine-1-phosphate: signaling inside and out. FEBS Lett，2000; 476:55-57

　　2 Yang L，Yatomi Y，Miura Y，et al. Metabolism and functional effects of sphingolipids in blood cells. Br J Haematol，1999; 107:282-293

　　3 Pyne S，Pyne NJ. Sphingosine 1-phosphate signalling in mammalian cells. Biochem J，2000; 349:385-402

　　4 达万明，黄文荣. 异基因外周血造血干/祖细胞移植的进展.临床血液学杂志，2003; 16:144-147

　　5 Olivera A，Spiegel S. Sphingosine kinase. Assay and product analysis. Methods Mol Biol，1998;105:233-242

　　6 Edsall LC，Spiegel S. Enzymatic measurement of sphingosine 1-phosphate. Anal Biochem，1999;272:80-86

　　7 黄文荣，王立生，达万明. 1-磷酸鞘氨醇对T细胞功能的影响. 中国实验血液学杂志，2005; 13:718-722

　　8 黄文荣，达万明. rhG-CSF在外周血造血干细胞动员过程中对T细胞的影响及机制.中国实验血液学杂志，2005; 13:338-342.