儿童和成人急性淋巴细胞白血病中Ki-67和Bcl-2表达的临床意义

　　作者：徐卫,李建勇,吴雨洁,盛瑞兰,陆　　作者单位：南京医科大学第一附属医院血液科, 南京 210029

　　【摘要】为了观察Ki-67和Bcl-2在儿童和成人ALL中的表达，探讨其与ALL免疫学分型和临床疗效的关系，用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(SAP)免疫组织化学染色的方法，对18例儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和43例成人ALL患者的骨髓或外周血进行Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的检测。结果表明：Ki-67抗原在儿童ALL中的表达略低于成人ALL，但差异无显著性(P>0.05);而Bcl-2蛋白在儿童ALL中的表达显著低于成人ALL(P<0.05);在儿童和成人ALL各免疫表型中，T细胞、伴有髓系抗原标记的急性淋巴细胞白血病(My+ALL)的Ki-67阳性表达率显著高于成人(P<0.05);儿童和成人ALL的完全缓解率(CR)在Ki-67和Bcl-2两项同时低表达组中最高，仅一项低表达组中次之，两项均高表达组中最低。结论：对儿童和成人ALL患者进行增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2的检测，能反映患者肿瘤细胞的增殖活性和凋亡抑制情况，Ki-67和Bcl-2的表达与白血病ALL类型和临床疗效密切相关。

　　【关键词】 急性淋巴细胞白血病;Ki-67 抗原;Bcl-2蛋白;免疫组织化学

　　Expression of Ki-67 and Bcl-2 in Adults and Children with Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Clinical Significance　XU Wei,LI Jian-Yong, WU Yu-Jie, SHENG Rui-Lan, LU Feng-XiangDepartment of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University , Nanjing 210029, China

　　AbstractTo evaluate the expressions of proliferative antigen Ki-67 and apoptosis-antagonizing protein Bcl-2 as well as their clinical significance， immunohistochemistry staining with SAP was used to detect Ki-67 antigen and Bcl-2 protein in 18 cases of children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) and 43 cases of adults with ALL. The resalts showed that the levels of Ki-67 and Bcl-2 expression in children with ALL were lower than that in adults, but only Bcl-2 expression had significant difference. Both in children and in adults, the levels of Ki-67 expression in T-ALL and My+ALL were higher than that in B-ALL and null-ALL. The highest complete remission rate (CR) was seen in the group with lower expression of both indexes ( Ki-67 and Bcl-2). The lowest CR rate was seen in the group with higher expression of both indexes. It is concluded that the levels of Ki-67 and Bcl-2 expression in children and adults with ALL were closely related with the subtype of ALL and chemotherapeutic effects.

　　Key wordsacute lymphoblastic leukemia; Ki-67 antigen; Bcl-2 protein; immunohistochemistry

　　急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种恶性淋巴增殖性疾病，白血病细胞的过度增殖和凋亡受抑是ALL的发病基础，与ALL的治疗和预后也密切相关。对ALL细胞进行增殖和凋亡的研究，有助于揭示部分ALL的发生、发展的机制，为ALL的诊断、治疗和预后提供有价值的指标。我们采集了18例儿童ALL和43例成人ALL患者的骨髓或外周血，用免疫组织化学染色的方法检测Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达水平，了解白血病细胞的增殖与凋亡情况，并进行疗效分析。

　　材料和方法

　　研究对象

　　18例儿童ALL和43例成人ALL均为在我院经细胞形态学、免疫学和分子生物学诊断的初诊患者。在儿童组中男性14例，女性4例;年龄2-13岁，中位年龄8岁;其中B-ALL 9例，T-ALL 5例， null-ALL 2例， 伴有髓系抗原标记的ALL(My+ALL)

　　2例。成人组中男性27例，女性16例;年龄14-72岁，中位年龄36岁; 其中B-ALL 24例，T-ALL 6例，null-ALL 7例，伴有髓系抗原标记的ALL(My+ALL)6例。

　　治疗方法

　　18例儿童ALL中3例采用DOP方案化疗，13例采用DOLP方案化疗，2例采用CDOLP方案化疗。43例成人ALL中有34例住院治疗，1例患者采用DOP方案化疗，10例采用CDOP方案化疗，8例采用DOLP方案化疗，4例采用MOLP方案化疗，11例采用CDOLP方案化疗。

　　测定方法

　　化疗前采集患者的骨髓或外周血(幼稚细胞比例≥0.50)，分离单个核细胞。Ki-67阳性对照为K562细胞株，Bcl-2阳性对照为HL-60细胞株。采用链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(SAP)免疫组织化学染色方法检测。第一抗体鼠抗人Ki-67单克隆抗体(MIB-1，Immunotech公司产品)和Bcl-2单克隆抗体(Bcl-2-124，Dako公司产品)各30 μl，37℃，45分钟;生物素标记的第二抗体30 μl，37℃，15 分钟;链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶溶液的第三抗体30 μl，37℃，15分钟;碱性磷酸酶底物显色，37℃，15分钟(以上各步骤均在湿盒中进行)，自来水冲洗，苏木素复染。

　　计数方法

　　油镜下随机计数200个肿瘤细胞，计算Ki-67阳性细胞指数(Ki-67LI)和Bcl-2阳性细胞指数(Bcl-2LI)。

　　疗效评价标准

　　疗效判断依据1987年苏州会议标准[1]。

　　统计学处理

　　数据以均数±SD表示，采用t检验，χ2检验处理。

　　结果

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白在儿童ALL和成人ALL中的表达

　　结果详见表1。在高倍视野下，Ki-67阳性细胞为细胞核染成红色，多以核仁染色强烈，Bcl-2阳性细胞为胞浆出现红色颗粒。此结果表明Ki-67抗原在儿童ALL中的表达低于成人ALL，经t检验，差异无显著性(P>0.05)。Bcl-2蛋白的表达在儿童ALL低于成人ALL，经t检验，差异有显著性(P<0.05)。Table 1. Ki-67LI(%) and Bcl-2LI(%) in adults and children with ALL(略)

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达与患者一般情况的关系

　　白血病细胞Ki-67抗原和Bcl-2蛋白的表达与患者性别、外周血白细胞计数及骨髓原始细胞数无相关性(P>0.05)。

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白在儿童和成人ALL各免疫表型中的表达

　　结果详见表2、3。儿童和成人ALL各免疫表型中，T细胞ALL和My+ALL的Ki-67LI较高，经t检验，差异有显著性(P<0.05)。

　　Table 2. Ki-67LI(%) and Bcl-2LI(%) in different immunophenotype of children with ALL(略)Table 3. Ki-67LI(%) and Bcl-2LI(%) in different immunophenotype of adults with ALL (略)

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白表达阳性率与儿童和成人ALL首次治疗疗效的关系

　　结果见表4、5。我们以Ki-67LI的15%及Bcl-2LI的10%为界将患者分别分为3组：两项同时低表达组(Ki-67LI≤15%和Bcl-2LI≤10%)、两项中任一项低表达组(Ki-67LI≤15%和Bcl-2LI>10%，或Ki-67LI>15%和Bcl-2LI≤10%)和两项均高表达组(Ki-67LI>15%和Bcl-2LI>10%)。儿童和成人ALL首次化疗CR率表现为在两项同时低表达组中最高，仅一项低表达组中次之，两项均高表达组中最低，且有显著性差异(P<0.01和<0.05)。Table 4. CR in different groups with Ki-67 and Bcl-2 expression in children with AL(略)Table 5. CR in different groups with Ki-67 and Bcl-2 expression in adults with ALL(略)

　　Ki-67抗原和Bcl-2蛋白表达阳性率与成人ALL生存期的关系

　　结果见表6。本组仅对成人ALL作生存期分析,随访时间2-38个月，中位随访时间15个月，其中18例已死亡。以Ki-67LI的15%及Bcl-2LI的10%为界将患者分别分为2组，用Kaplan-Meier生存曲线分析这2组患者的预后，结果见图1、图2。经Log-Rank显著性检验，结果Ki-67LI≤15%与Ki-67LI>15%两组的生存时间差异有显著性(P<0.01)。这表明Ki-67LI与ALL的生存时间密切相关，Ki-67LI低的，生存时间长，Ki-67LI高的，生存时间短。而Bcl-2LI≤10%与Bcl-2LI>10%两组之间差异无显著性(P>0.05)。

　　Table 6. Survival time in different groups with Ki-67 and Bcl-2 expression in adults with ALL(略)

　　adults with ALL讨论

　　细胞过度增殖和凋亡受阻是肿瘤发生的基础。Ki-67抗原是一种人类增殖细胞核抗原，在G0和G1早期细胞不表达，G1中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，M期达到最高值，M期后迅速降解或丢失抗原决定簇[2]。根据Ki-67抗原在细胞中表达与分布的特点，可确定细胞处在增殖周期中的时相。Ki-67单克隆抗体因生长在培养板的第67孔而得名，可识别细胞周期中G1、S、G2、M期的核抗原，与细胞增殖密切相关。Ki-67因其半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速降解，检测结果的可靠性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原(PCNA)。因此，Ki-67被认为能较可靠地全面反映细胞增殖活性的指标。细胞过度增殖是肿瘤形成和发展的重要原因，白血病细胞的增殖状况与其治疗和预后密切相关。文献报道,Ki-67阳性率的检测对选择细胞周期特异性药物化疗具有重要作用,阳性率高的AL，对周期特异性化疗药物敏感;阳性率低的，对周期特异性药物不敏感[3]。Kaaijk等[4]体外实验发现在儿童初发ALL中，细胞增殖活性强的对抗代谢药物、左旋门冬酰氨酶和长春新碱敏感，而复发ALL中无此现象发现。Nowicki等[5]认为儿童ALL早期化疗失败与Ki-67低表达密切相关。

　　Shirono等[6]根据外周血T淋巴细胞Ki-67阳性率对成人T淋巴细胞白血病(ATL)作了新的临床分类：包括①进展期ATL：外周血T淋巴细胞的Ki-67阳性率>18%，中位生存期105天;②稳定期ATL：阳性率<18%，中位生存期750天。Bcl-2基因定位于染色体18q21上，其主要生物学功能为抑制细胞凋亡[7]，延长细胞寿命，增加细胞对各种凋亡刺激因素的抗性，但不影响细胞的分裂与增殖。Bcl-2基因在一些肿瘤组织中有高表达，这种高表达使肿瘤细胞抵抗化疗药物的攻击。体外实验显示，Bcl-2表达增强可使白血病细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡，使肿瘤细胞对各种化疗药物耐受，因而缓解率低。本研究通过对增殖相关抗原Ki-67和抗凋亡蛋白Bcl-2的同时检测，研究儿童ALL和成人ALL中的细胞的增殖和凋亡情况，及其与ALL免疫学分型和临床疗效的关系，探讨其临床意义。研究资料显示：Ki-67抗原在儿童ALL中的表达低于成人ALL，但差异无显著性;而Bcl-2蛋白在儿童ALL中的表达同样低于成人ALL，且差异有显著性;儿童和成人ALL的CR率在Ki-67和Bcl-2两项同时低表达组中最高，仅一项低表达组中次之，两项均高表达组中最低;在ALL各免疫表型中Ki-67的表达存在差异，T细胞ALL和My+ALL的Ki-67LI较B细胞ALL和null-ALL的高。这一结果一方面可为儿童ALL较成人易于缓解提供了理论依据，另一方面似可提示儿童ALL中一小部分不易缓解患者可能与Bcl-2蛋白高表达有关。由于本组病例观察时间较短，病例数有限，其表达差异是否有助于预后的评估有待于大量病例资料的继续积累和研究。

　　【参考文献】

　　1 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京:科学技术出版社, 1998: 184-214

　　2 Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation - associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody. J Immunol, 1984; 133: 1710-1715

　　3 Ito M, Tsurusawa M, Kawai S, et al, Expression of a proliferation associated-nuclear antigen defined by Ki-67 monoclonal antibody in childhood acute leukemia. Rinsho-ketsueki. 1995; 36:713-719

　　4 Kaaijk P, Kaspers GJ, Van Wering ER, et al. Cell proliferation is related to in vitro drug resistance in childhood acute leukaemia. Br J Cancer. 2003; 88: 775-781

　　5 Nowicki M, Miskowiak B, Kaczmarek-Kanold M. Correlation between early treatment failure and Ki67 antigen expression in blast cells of children with acute lymphoblastic leukaemia before commencing treatment. A retrospective study. Oncology, 2002; 62: 55-59

　　6 Shirono K, Hattori T, Takatsuki K. A new classification of clinical stages of adult T-cell leukemia based on prognosis of the disease. Leukemia, 1994; 8:1834-1837

　　7 Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature, 1990; 348: 334-336.