慢性粒细胞白血病细胞eIF4E mRNA表达及影响因素

　　作者：黄莲芬,罗红伟,肖青,彭辉,冯文莉　　作者单位：重庆医科大学：1医学检验系, 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室, 2附属第一医院血液科，重庆 400016

　　【摘要】目的初步探索真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)在慢性粒细胞白血病(CML)不同病程，包括慢性期(CP)、加速期(AP)、急变期(BC)、急变治疗后(BCR)骨髓细胞中mRNA表达及其在K562细胞中的表达影响因素. 方法： RTPCR检测25例骨髓样本[CML急变期(CMLBC)10例，慢性期(CMLCP)8例，加速期(CMLAP)1例，急变期治疗后(CMLBCR)3例，贫血对照3例]eIF4E mRNA表达，及其中9例CML eIF4E和RNA结合蛋白K(hnRNP K)mRNA表达，并分析两种基因表达相关性. 用酪氨酸激酶抑制剂STI571处理K562细胞，并用hnRNP K 短发夹RNA(shRNA)逆转录病毒载体感染K562细胞，经G418稳定筛选，分别检测eIF4E mRNA表达变化. 结果： 与贫血对照组相比，CMLBC和CMLBCR eIF4E mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)，而与CMLCP无统计学意义，hnRNP K与eIF4E mRNA表达呈线性相关(r=0.79, P<0.01).STI571能轻微下调 K562细胞eIF4E mRNA表达.hnRNP K干扰组hnRNP K和eIF4E mRNA表达比空载对照组分别下降55.22%，55.27%. 结论： CML急变期eIF4E mRNA表达显著增高，BCR/ABL融合蛋白可能参与调节eIF4E mRNA表达但效应有限，hnRNP K分子在eIF4E mRNA表达调控中可能发挥一定作用.

　　【关键词】 白血病，髓样，慢性;真核细胞起始因子4E;STI571;核糖核蛋白K，核不均一

　　0引言

　　慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)是源于造血干细胞异常的恶性克隆性增殖性疾病，具有特征性的ph染色体和bcr/abl融合基因，所编码的BCR/ABL融合蛋白具有异常的酪氨酸激酶活性，是CML发生和发展的主要因素，在CML从慢性期(CMLCP)向急变期(CMLBC)转化过程中起关键作用，然而急变的具体机制仍不清楚.研究报道，真核细胞翻译起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)在很多的人类肿瘤中过表达，可促进肿瘤增殖[1]，抑制凋亡[2]，阻滞分化[1,3-4].研究[5]发现，mRNA帽结合复合物(eIF4F)是CML急变时一个重要治疗靶标，而eIF4E是该复合物重要的组成部分.已知RNA结合蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)在CML急变细胞中高表达[6]，而hnRNP K蛋白在Hela细胞中通过转录水平升高eIF4E表达而诱导恶性表型发生[7].我们选择eIF4E为切入点，采用RTPCR技术在CML细胞中检测eIF4E mRNA表达，并进一步探讨其与BCR/ABL融合蛋白及其下游分子hnRNP K之间的关系，旨在为CML急变提供新的分子治疗靶点.

　　1材料和方法

　　1.1材料采集2006/2007年间重庆医科大学附属第一、二医院血液科诊断为CML的患者骨髓标本22例，其中,CMLCP 8例，加速期(CMLAP)1例， CMLBC 10例，急变治疗后有所缓解(CMLBCR)3例，以及贫血对照骨髓3例.MMLV逆转录试剂盒，限制性内切酶EcorⅠ，HindⅢ，DNA Marker等(TaKaRa公司);质粒抽提试剂盒(Qiagen公司);TransfastTM转染试剂(Promega公司);G418(Invitrogen公司);酪氨酸激酶抑制剂STI571获赠于诺华制药公司.DH5α菌株和K562细胞株和PT67细胞由本室储存.pSUPER retro hnRNP K shRNA(含有5′tggtgaatttggtaaacgc3′)和pSUPER retro neo+gfp逆转录病毒载体获赠于Danilo Perrotti教授[6].根据人eIF4E mRNA序列(NM_001968)以及hnRNP K mRNA序列(NM_002140，NM_031262，NM_031263)，利用Primer Premier 5.0软件自行设计PCR引物，由上海生物工程技术有限公司合成.eIF4E引物,P1：5′ACGGAATCTAATCAGGAGGT3′，P2：5′TTCCCACATAGGCTCAATAC3′，产物长度：246 bp.hnRNP K引物，P1：5′CCCGATAGGGTTGTAGAGTG3′，P2：5′ATTGCAGAG TCCCAAGTTTC3′，产物长度：452 bp.βactin引物，P1：5′GTGGACATCCGCAAAGAC3′，P2：5′AAAGG GTGTAACGCAACTAA3′，产物长度：302 bp.

　　1.2方法

　　1.2.1骨髓单个核细胞的分离及总RNA提取取抗凝骨髓2 mL，加入等量的Hanks液稀释，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞并根据Trizol法提取总RNA步骤，提取骨髓总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度，并计算其含量.

　　1.2.2RTPCR检测CML和贫血对照骨髓eIF4E，hnRNP K mRNA表达每20 μL逆转录反应体系用总RNA 1 μg，按MMLV逆转录试剂盒说明书将其逆转录成cDNA，cDNA产物于-20℃保存. PCR扩增采用20 μL体系，内含cDNA 2 μL， 10 μmol/L引物0.5 μL，10×PCR缓冲液2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL， 2.5 μmol/L dNTP 2 μL，Taq酶0.5 U. βactin基因扩增条件：94℃ 预变性3 min，再94℃ 20 s，56℃ 40 s，72℃ 20 s 28个循环，72℃ 延伸10 min，eIF4E基因扩增条件：94℃ 预变性5 min，再94℃ 20 s，60℃ 40 s，72℃ 20 s 5个循环后，再94℃ 20 s，56℃ 40 s，72℃ 20 s 25个循环，72℃延伸10 min，hnRNP K基因扩增条件：94℃预变性5 min，再94℃ 20 s，56℃ 40 s，72℃ 20 s 29个循环后，72℃ 延伸10 min.扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相，在BioRad凝胶成像仪上观察分析，以目的基因/βactin的比值R代表目的基因相对表达丰度.

　　1.2.3RTPCR检测STI571对K562细胞eIF4E mRNA表达的影响常规培养K562细胞，新鲜换液后将K562细胞按1×106个/孔加到6孔板中，共6孔，第1孔不加任何物质，第2孔加入DMSO溶剂作为溶剂空白对照，第3，4，5，6孔加入DMSO融解的STI571使其终浓度分别为0.5，1.0，2.5，5.0 μmol/L，处理24 h后收集6孔处理组细胞，Trizol法裂解提取总RNA，逆转录成cDNA后，PCR扩增eIF4E和βactin基因反应条件和分析同上，计算与实验平行的未处理对照组(a), DMSO试剂空白对照组和各浓度STI571处理组eIF4E基因/βactin基因条带灰度值比值，记为R.

　　1.2.4RTPCR检测hnRNP K shRNA对 K562细胞eIF4E和hnRNP K mRNA表达的影响将pSUPER retro hnRNP K shRNA逆转录病毒载体和空载pSUPER retro neo+gfp分别转化至DH5α感受态细菌，增菌提取质粒后经EcorⅠ和HindⅢ酶切和测序鉴定，克隆质粒序列正确. 用TransfastTM脂质体将质粒转染PT67包装细胞，转染后G418筛选约2 wk，挑取绿色荧光克隆扩大培养，建立逆转录病毒稳定包装细胞株，收集hnRNP K shRNA和空载对照逆转录病毒上清用于感染K562细胞，经用G418筛选，获得稳定表达hnRNP K shRNA以及空载对照组K562细胞.Trizol法提取各处理组总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增eIF4E，βactin和hnRNP K基因反应条件和分析同上，计算各处理组目的基因/βactin基因条带灰度值比值R.由于eIF4E基因与细胞分化有关，而K562细胞随着培养时间的延长极易发生自分化，故设立与实验平行的未处理对照组(a),以及该组细胞继续培养3 wk的另一未处理对照组(b).

　　统计学处理： 用SPSS11.5统计学软件进行多个样本均数与贫血对照组均数比较的Dunnettt检验，以及相关和回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1CML和正常骨髓细胞中eIF4E 和hnRNP K mRNA的表达RTPCR检测22例中的10例CML和3例贫血对照骨髓βactin和eIF4E基因，以及其中9例CML hnRNP K mRNA表达(图1).CMLCP，CMLBC，CMLBCR组CML骨髓eIF4E基因R值分别为0.47±0.13,1.04±0.13,0.67±0.04，对照组骨髓eIF4E基因R值为0.32±0.12.CMLBC，CMLBCR组eIF4E mRNA的表达与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，而CMLCP组与对照组相比，差异无统计学意义.以反映K562细胞和9例CML骨髓细胞hnRNP K和eIF4E mRNA表达的R值分别作为自变量X和应变量Y绘制成散点图(图2)，发现X与Y有伴随线性趋势，相关分析得到两者相关系数r=0.79，P<0.01，线性回归得Y=0.15+0.56X.

　　A：CML骨髓eIF4E mRNA表达;1~10：10例CML骨髓样本;M：DL2000 marker. B：CML骨髓βactin mRNA表达;1~10：10例CML骨髓样本;M：DL2000 marker. C：CML骨髓hnRNP K mRNA表达;1~9: 9例CML骨髓样本;M：DL2000 marker. D：贫血对照骨髓eIF4E和βactin mRNA;1~3：3例贫血对照骨髓;K：K562细胞;M：DL2000 marker.

　　图1CML和贫血对照骨髓细胞eIF4E和hnRNP K基因RTPCR电泳

　　2.2STI571对K562细胞eIF4E mRNA表达的影响未处理对照组、DMSO试剂空白对照组及0.5，1.0，2.5，5.0 μmol/L 4种STI571浓度处理组K562细胞eIF4E mRNA RTPCR电泳结果见图3. STI571在一定程度上能够使K562细胞中eIF4E mRNA表达降低.

　　图29例CML和K562细胞eIF4E和hnRNP K基因R值散点图

　　A：各浓度STI571处理组K562细胞eIF4E mRNA表达;1~4：5.0, 2.5, 1.0, 0.5 μmol/L STI571浓度处理组;5：DMSO试剂空白对照组;6：未处理对照组(a);M：DL2000 marker. B：各浓度STI571处理组K562细胞βactin mRNA表达;1~4：5.0, 2.5, 1.0, 0.5 μmol/L STI571浓度处理组;5：DMSO试剂空白对照组;6：未处理对照组(a);M：DL2000 marker.

　　图3各浓度STI571处理组K562细胞eIF4E和βactin mRNA表达RTPCR电泳

　　2.3hnRNP K shRNA对K562细胞eIF4E和 hnRNP K mRNA表达的影响hnRNP K干扰组和空载对照组K562细胞eIF4E和hnRNP K RTPCR电泳结果分别见图4，5.各组K562细胞hnRNP K基因计算所得R值分别为：干扰组0.79，空载对照组1.77，未处理对照组1.32，eIF4E基因各处理组所得R值分别为：干扰组D 0.24，空载对照组C 0.54，未处理对照组(a)为0.51，未处理对照组(b)为0.69.干扰组hnRNP K mRNA表达较空载对照组降低了55.22%，而eIF4E mRNA表达较空载对照组降低55.27%.

　　1：未处理对照组(a);2：空载对照组;3：干扰组;M：DL2000marker.

　　图4各处理组K562细胞hnRNP K基因RTPCR电泳

　　1: 未处理对照组(b);2：未处理对照组(a);3：空载对照组;4：干扰组;M：DL2000marker.

　　图5各处理组K562细胞eIF4E基因RTPCR电泳

　　3讨论

　　新近发现的原癌基因eIF4E在调节细胞蛋白质合成和帽依赖翻译中起重要作用，过表达eIF4E蛋白可加强蛋白质合成速度，加速mRNA由细胞核向细胞质转移，选择性加强原癌基因等弱“RNA”的翻译[8]，亦参与控制细胞周期进展和细胞增殖[9].在CML慢性期晚期，eIF4E蛋白表达水平和磷酸化以BCR/ABL依赖方式升高[10]，Topisirovic[3]等报道CML急变期eIF4E表达水平升高，提示eIF4E可能与CML病程进展有关.CML细胞中hnRNP K蛋白表达水平呈BCR/ABL依赖方式升高[6]，而hnRNP K蛋白在Hela细胞中通过转录水平升高eIF4E表达而诱导细胞恶性表型发生[7].我们的预实验显示，CML急性红系变K562细胞株中eIF4E mRNA高表达，CML急变期细胞高表达hnRNP K蛋白，提示CML急变期细胞中hnRNP K蛋白可能与eIF4E基因表达有关.

　　我们的实验结果表明，CMLBC而非慢性期eIF4E基因mRNA表达较贫血对照显著升高，说明eIF4E mRNA表达与CML病程有关，而eIF4E和hnRNP K mRNA表达水平呈线性正相关，提示CMLBC eIF4E mRNA表达显著升高可能与hnRNP K高表达有关. K562细胞中，STI571可以在一定程度下调eIF4E mRNA水平，但是eIF4E mRNA表达仍然很高，说明BCR/ABL融合蛋白可能参与促进eIF4E表达，但是很可能还有其它因素在调控eIF4E表达中发挥重要作用. 另外，hnRNP K基因沉默能显著降低hnRNP K和eIF4E mRNA水平，提示hnRNP K很可能在eIF4E mRNA表达调控中发挥一定作用.

　　研究[11]表明，cmyc蛋白促进elF4E基因转录，K562细胞中p53蛋白通过结合cmyc蛋白而抑制elF4E基因转录，而CML急变时常常伴随p53基因突变或缺失，同时，在CML急变细胞中HnRNP K蛋白高表达，它从翻译水平促进cmyc蛋白表达[6]，这些可能都是eIF4E表达过高的原因. 以上分析表明，eIF4E可能是CML急变一个重要的癌基因，而通过靶向抑制eIF4E来治疗肿瘤的临床实验也正在进行中[12]，我们的结果提示，eIF4E有可能成为CML急变期一新的潜在治疗靶点，为我们进一步的深入研究奠定了一定的基础.

　　致谢衷心感谢重庆医科大学附属第一医院血液骨髓室潘健老师和本课题组全体成员，临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室全体老师!

　　【参考文献】

　　[1] Provenzani A, Fronza R, Loreni F, et al.Global alterations in mRNA polysomal recruitment in a cell model of colorectal cancer progression to metastasis[J]. Carcinogenesis, 2006, 27(7): 1323-1333.

　　[2] Larsson O, David MP, Fan DH, et al.Apoptosis resistance downstream of eIF4E: posttranscriptional activation of an antiapoptotic transcript carrying a consensus hairpin structure[J]. Nucleic Acid Res, 2006, 34(16): 4375-4386.

　　[3] Topisirovic I, Guzman ML, McConnell MJ, et al. Aberrant eukaryotic translation initiation factor 4Edependent mRNA transport impedes hematopoietic differentiation and contributes to leukemogenesis[J]. Mol Cell Biol, 2003, 23(24):8992-9002.

　　[4] Montserrat PD, Godfrey G, Lindern M. Translation initiation factor 4E inhibits differentiation of erythroid progenitors[J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(19): 8496-8506.

　　[5] Prabhu S, Saadat D, Zhang M. A novel mechanism for BcrAbl action: BcrAblmediated induction of the eIF4F translation initiation complex and mRNA translation[J]. Oncogene, 2007, 26(8):1188-2000.

　　[6] Notari M, Neviani P, Perrotti D, et al. A MAPK/HNRNP K pathway controls BCR/ABL oncogenic potential by regulating MYC mRNA translation[J]. Blood, 2006, 107(6):2507-2516.

　　[7] Lynch M, Chen L, Michael J, et al. hnRNP K binds a core polypyrimidine element in the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) promoter, and its regulation of eIF4E contributes to neoplastic transformation[J]. Mol Cell Biol， 2005, 25(15): 6436-6453.

　　[8] De BenedettiA, Graff JR. eIF4E expression and its role in malignancies and metastases[J]. Oncogene, 2004, 23(18): 3189-3199.

　　[9] Culjkovic B, Topisirovic I, Borden KL.Controlling gene expression through RNA regulons: the role of the eukaryotic translation initiation factor eIF4E[J]. Cell Cycle, 2007, 6(1):65-69.

　　[10] Zhang M, Moore CJ, Ko J. Increased eIF4E expression and phosphorylation in late phase chronic myelogenous leukemia occurs in a BcrAbldependent manner, and can be targeted by a novel mnk kinase inhibitor, CGP57380, to overcome imatinibresistance[R]. Blood Annu Meeting, 2006.

　　[11] Zhu N, Gu L, Findley HW. Transcriptional repression of the eukaryotic initiation factor 4E gene by wild type p53[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 335(4):1272-1279.

　　[12] Graff JR, Konicek BW, Carter JH, et al. Targeting the eukaryotic translation initiation factor 4E for cancer therapy[J]. Cancer Res, 2008, 68(3):631-634.