hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

　　作者：孙玲,王峰,孙慧,乐晓萍,葛秀峰,姜中兴　　作者单位：郑州大学第一附属医院血液内科，郑州 450052 ; 1郑州大学医学院分子细胞生物学研究中心，郑州 450052;基金项目：河南省医学科技创新人才工程项目，编号 2004107031

　　【摘要】为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用，并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系，应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达，RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况，倒置显微镜观察细胞形态变化，MTT法检测细胞增殖状态，应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现：反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后，hTERT基因表达明显受抑，细胞生长受抑，增殖能力减弱，其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示：反义寡核苷酸10、20和30 μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39，0.944±0.16，与未作用组(2.648±0.42)比较，差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20 μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±065)与未作用组比较，差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明： hTERT ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少，以30 μmol/L作用组条带最少。结论： hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖，下调端粒酶活性。

　　【关键词】 HL-60细胞; hTERT; 反义寡核苷酸; 端粒酶活性

　　Inhibition of hTERT Antisense Oligodeoxynucleotide on Proliferation and Telomerase Activity in HL-60 Cells　SUN Ling，WANG Feng，SUN Hui，YUE Xiao-Ping，GE Xiu-Feng，JIANG Zhong-Xing，ZHANG Qin-Xian　Department of Hematology，The First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China; 1Molecular Cell Biology Research Center，Zhengzhou University Medical College，Zhengzhou 450052，China

　　Abstract This study was purposed to investigate the inhibition of hTERT antisense oligodeoxynucleotide(ASODN) on the proliferation and telomerase activity in HL-60 cells and to explore the relativity between the telomerase activity and the expression of hTERT gene in HL-60 cells. After treated by hTERT ASODN the expression of hTERT was detected by RT-PCR，the morphological changes of HL-60 cells was observed with inverted microscopy，the cell proliferation was measured by MTT method，and the telomerase activity was determined with TRAP-ELISA and TRAP-PAGE. The results showed that after sealing hTERT gene with ASODN for 72 hours，the expression of hTERT gene was significantly inhibited，the cell growth was repressed and the ability of proliferation decreased，and the effect was specific in sequence and dependent in dose and time. OD450-690 values were 2.648±0.42，1.504±0.47，1.223±0.39，0.944±0.16 respectively，as the cells were treated with 0，10，20，30 μmol/L ASODN for 72 hours. The difference was significant as compared 10，20，30 μmol/L groups with 0 μmol/L ASODN group respectively (P<0.05)，but the difference was no significant when compared 20 μmol/L SODN group (2.376±0.65) with untreated group (2.648±0.42) (P>0.05). TRAP-PAGE detection revealed that comparing ASODN groups with SODN groups the telomerase image bands were decreased and least was found in groups of 30 ±mol/L. It is concluded that the hTERT ASODN may inhibit the proliferation and down-regulate the telomerase activity in HL-60 cells by sealing the expression of hTERT gene.

　　Key words HL-60 cell; hTERT; antisense oligodeoxynucleotide; telomerase activity

　　端粒是真核细胞染色体末端特有的保护性结构，它能维持染色体末端的完整性。随着细胞的分裂、分化，端粒逐渐缩短，当端粒缩短至一定程度，细胞将出现衰老、死亡。端粒酶是一种逆转录酶，它能合成端粒并接到染色体末端，补充由于DNA分裂造成的端粒缩短，从而维持端粒长度，使细胞永生化[1]。研究表明：端粒酶活性增高与许多肿瘤的发生密切相关，在急性白血病中存在端粒酶的高表达[2]。人们普遍认为，端粒酶活化是肿瘤细胞无限增殖的必要条件。抑制端粒酶的活性可以达到抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的目的。人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTRET)基因与端粒酶活性具有直接相关性[3]。我们利用反义技术将hTERT反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)导入人类髓性白血病细胞株HL-60细胞，探讨其对白血病细胞的增殖及端粒酶活性的影响，为开辟白血病治疗新途径提供有价值的实验室资料。

　　材料和方法

　　细胞培养

　　HL-60细胞为郑州大学医学院组胚教研室保存株，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，将HL-60细胞置37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养。实验选用对数生长期细胞，细胞悬浮成团，生长良好，隔天换液并传代1次，成活率>95%。

　　反义核酸的设计与合成

　　选择端粒酶hTERT mRNA转译起始区作为靶点合成全硫代修饰的反义寡核苷酸(ASODN)片段;另设正义全硫代修饰的寡核苷酸(SODN)片段作为对照。合成序列如下： h-ASODN: 5’-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3’;

　　h-SODN: 5’-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3’。

　　经计算机检索证实，反义片段与其它已知的人类基因无同源性。所有寡核苷酸均由上海Sangon生物工程技术服务公司391型DNA合成仪(PE公司)合成，并纯化、分装，-20℃保存待用。

　　转染及药物敏感试验

　　按照OligofectamineTM Reagent(Invitrogen公司)说明书步骤，将纯化的ASODN、SODN溶于不含抗生素及胎牛血清的RPMI 1640培养液中，每组浓度分别为5、10、20、30 μmol/L。取2.5 μl不同浓度的ASODN分别加入40 μl无血清培养液，此为A液;6 μl无血清培养液中加入1.5 μl转染液，室温孵育10分钟，此为B液。将B液分别加入A液中，轻轻混匀，室温放置15-20分钟。同时取对数生长期的HL-60细胞200 μl (含细胞1.5×105)，加入A、B液调成250 μl，接种于24孔板中，置5% CO2孵箱中转染4小时后，加入新鲜的含30%胎牛血清的RPMI 1640液125 μl继续培养，每个浓度组均设立3个平行复孔。同时设未作用组为空白对照(即不加任何寡核苷酸作用的HL-60细胞)。分别培养24、48、72、96小时，用MTT法测定细胞生长抑制率。测定前4小时加入MTT液，4小时后加入溶解液DMSO，待结晶完全溶解后于全自动酶标仪上在波长490 nm处测定每孔吸光度OD490。计算生长抑制率：生长抑制率=[(未处理组吸光度-处理组吸光度)/未处理组吸光度]×100%

　　细胞形态学观察

　　在细胞培养状态下，用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态学改变。

　　细胞增殖能力检测

　　取对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为5×104/ml。用20 μmol/L ASODN、SODN分别转染细胞，每组设3个复孔。常规培养24、48、72、96小时后采用4 g/L台盼蓝染色，计数板计数法进行细胞计数，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。

　　转染细胞hTERT mRNA表达的检测

　　于转染后72小时收集不同处理组HL-60细胞3×106个，以TRIZOL RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA。采用AMV一步法RT-PCR试剂盒检测hTERT mRNA的表达。hTERT上游引物： 5’-CTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3’，hTERT下游引物: 5’- GGGCTGCTGGTGTCTGCTCTCG-3’;以β-actin为内参照，上游引物：5’-TCCTGTGGCATCCACGAAA-CT-3’，下游引物：5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果并拍照成像。

　　端粒酶活性检测

　　用Telomerase PCR ELISA试剂盒(Roche公司产品)进行检测。

　　端粒酶提取物的制备 收集2×105个细胞，用PBS洗2次，加入200 μl裂解液。充分混匀，4℃裂解30分钟，16 000×g离心10分钟，小心地将上清(约175 μl)移至另一洁净管中，-70℃保存备用或即用。紫外吸收法测定蛋白质含量。阳性对照为人胚肾细胞293细胞株(试剂盒提供)，阴性对照为端粒酶提取物加1 μg/μl RNase A，37℃孵育20分钟。RT-PCR扩增 取上述提取液5-20 μl(蛋白质含量10 μg)加入25 μl 反应混合液，用无菌DEPC水补充至50 μl，加入PCR扩增管。PCR扩增: 25℃引物延伸30分钟;94℃端粒酶灭活5分钟;扩增反应: 94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，循环30次;72℃平衡10分钟。

　　端粒酶活性的TRAP-ELISA检测

　　取上述PCR产物5 μl加变性液20 μl混匀，室温放置10分钟，加入225 μl杂交液(含地高辛标记的探针)，混匀后取出100 μl放于包被抗生物素的酶标板中，20℃作用2小时，加入过氧化物酶并与TMB底物显色30分钟，最后加终止液100 μl，用时间分辨荧光仪测定A值(波长为450 nm和690 nm)，A=OD450-OD690。A值代表细胞端粒酶活性。

　　聚丙烯凝胶电泳及银染

　　配12%非变性聚丙烯凝胶，聚合1-2小时，小心取出梳子，立即冲洗加样孔，加入扩增产物25 μl，130 V电泳1.5-2小时，(电泳50%的胶长)取出凝胶进行银染。先将凝胶放入10%的乙醇中固定10 分钟，用ddH2O清洗1次;1%硝酸溶液中浸洗3分钟，用ddH2O清洗2次;0.2%硝酸银浸洗30分钟进行染色，用ddH2O清洗2次;0.28 mol/L碳酸钠并0.019%甲醛显色至特异性梯形条带现出;10%醋酸浸洗2分钟进行分化去除背景杂色，自来水冲洗，数码相机照像。

　　统计学处理

　　数据应用均数±标准差(X ±SD)表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数的比较采用方差分析。以α =0.05为检验水准。

　　结果

　　hTERT ASODN对HL-60细胞生长的影响

　　不同浓度ASODN对HL-60细胞的生长均有抑制作用，且抑制率与剂量呈正相关，第24、48、72和96小时相关系数分别为0.951、0959、0.960、0.958(P<0.05)。抑制作用于转染后72小时最明显，以后则下降。SODN组抑制作用不明显，与ASODN组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

　　细胞增殖能力检测

　　未转染HL-60细胞于24-96小时呈指数增殖，实验测得细胞倍增时间为20-24小时;20 μmol/L ASODN转染组细胞于24小时开始受抑制，之后更为明显，细胞倍增时间延长为24-28小时;而20 μmol/L SODN对细胞的抑制作用不明显，细胞数仅较未转染组稍下降，细胞倍增时间无变化(图1)。Table 1. Inhibition of hTERT ASODN on the growth of HL-60 cells(略)

　　转染前后HL-60细胞的形态学改变

　　导入反义寡核苷酸72小时后，倒置显微镜下观察发现，SODN组、空白对照组细胞均呈半贴壁生长，细胞轮廓清楚，生长旺盛;而ASODN组细胞集落减少，细胞中颗粒增多，并随作用浓度增高细胞碎片增多(图2)。

　　转染细胞hTERT mRNA表达的检测

　　经RT-PCR扩增后，凝胶成像可见内参照β-actin扩增片段大小为315 bp，各组电泳条带无明显变化。hTERT扩增片段大小为705 bp，其中30 μmol/L ASODN作用72小时后hTERT扩增条带较其它各组明显减弱;而20 μmol/L ASODN作用组扩增条带也较20 μmol/L SODN组及未作用组明显地减弱(图3)。

　　端粒酶活性的定量检测

　　不同浓度ASODN、SODN与转染HL-60细胞作用72小时后，端粒酶活性随反义寡核苷酸作用浓度增加而降低，10、20、30 μmol/L hTERT ASODN作用组分别与未作用组比较，差异有统计学意义(P<0.05);SODN作用组与未作用组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。Table 2. Inhibition of hTERT ASODN with different doses on telomerase activity of HL-60 cells(略)

　　端粒酶活性的定性检测

　　将不同转染组的TRAP-PCR 产物经聚丙烯凝胶电泳和银染，结果显示hTERT ASODN随作用浓度的增加端粒酶梯度条带较逐渐减少，ASODN作用组较SODN作用组端粒酶梯度带明显减少(图4)。

　　讨 论

　　近年来，端粒酶与肿瘤细胞相关性备受关注。端粒酶是一种核糖蛋白复合体，主要由3个部分组成：人类端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1)和人类端粒酶逆转录酶(hTERT)。大量研究表明，端粒酶活化是恶性肿瘤细胞无限增殖的基础[4，5]。Kim等[6]发现，98%的永生化细胞株和90%的恶性肿瘤细胞端粒酶活性增强，而良性细胞及正常体细胞低表达或无端粒酶活性。Bodnar等[7]在正常人体细胞中导入端粒酶，细胞获得了永生化并形成肿瘤细胞，这一结果初步证明了端粒酶的激活与细胞的无限增殖有关，在肿瘤发生过程中具有重要作用。

　　造血系统恶性肿瘤细胞普遍表现有端粒酶活性，不同肿瘤细胞的端粒酶活性水平不同，以急性白血病细胞中端粒酶活性最强[2]。Xu等[8]测定66例急性髓性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者端粒酶活性，阳性率为87%(82/95)。Kubuki 等[9]认为，端粒酶活性及端粒长度与成人T急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的预后有关。Seol等[10]检测发现，所有AML病人的端粒酶活性均为阳性，但存在异质性。Ohyashki等[11]的研究结果为81.8%(45/55)的AML和69.6%(16/23)的 ALL的端粒酶活性为阳性。AML的端粒酶检出阳性率高于ALL，这可能与两种白血病的增殖状况和分化特征不同有关。

　　有资料显示，将hTERT导入正常细胞可使端粒酶活化，不表达端粒酶活性的细胞也不表达hTERT基因[12，13]。改变hTERT中的氨基酸排列顺序，端粒酶活性将减低或消失[14]。体外利用hTERT蛋白和hTR重组端粒酶的实验表明，hTERT和hTR构成端粒酶核心催化功能[15]，在肿瘤细胞中hTERT的抑制可以直接导致端粒酶的失活[16]。已经证实，人类髓系白血病细胞系是hTERT高表达的细胞系。本研究采用倒置显微镜观察hTERT寡核苷酸转染HL-60 72小时后的细胞形态学改变，发现SODN组及空白对照组细胞轮廓清楚，生长旺盛;而ASODN组细胞集落减少，细胞碎片增多。采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测5、10、20、30 μmol/L hTERT基因ASODN转染HL-60细胞72小时后增殖情况。结果显示，HL-60细胞增值计数及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性明显受抑，其抑制作用随浓度的升高而增强。20 μmol/L ASODN与30 μmol/L ASODN对HL-60细胞生长的抑制作用差别不明显。相同浓度SODN组及空白对照组SDH活性无明显变化。RT-PCR结果显示，采用5、10、20 μmol/L hTERT ASODN转染HL-60细胞72小时后，不同浓度的ASODN作用组目的基因扩增条带的灰度较SODN组及空白对照组明显减弱，减弱程度与作用浓度呈正相关。我们的研究结果表明，hTERT ASODN对HL-60细胞增殖及hTERT mRNA表达具有明显的抑制作用，作用的最佳浓度为20 μmol/L，而SODN组的抑制作用不明显，这说明hTERT ASODN对HL-60细胞增殖的抑制作用具有序列特异性和时间、浓度依赖性。本研究采用浓度为10和20 μmol/L的hTERT ASODN作用HL-60细胞24、48、72小时，TRAP-PCR 产物经聚丙烯凝胶电泳显示：随ASODN作用浓度的增加和作用时间的延长、端粒酶梯度条带逐渐减少;ASODN作用组较SODN作用组端粒酶梯度条带明显减少。TRAP-ELISA端粒酶活性定量结果显示，寡核苷酸转染细胞72小时后，hTERT ASODN对HL-60细胞的端粒酶活性具有明显抑制作用，其作用随浓度的升高而增强，与相同浓度SODN组及空白对照组比较，有显著性差异。hTERT ASODN 50%抑制效应(IC50)值为20 μmol/L。端粒酶活性定性定量结果表明，hTERT ASODN能有效抑制HL-60细胞的端粒酶活性，且端粒酶活性与hTERT mRNA转录水平保持一致。由此推断，hTERT ASODN通过抑制hTERT基因而下调端粒酶活性及细胞增殖达到抑制白血病细胞的目的。hTERT ASODN有希望发展为治疗白血病的核酸药物。

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