人类血小板同种抗原研究进展

　　作者：黄慧　冯明亮　刘达庄　　作者单位：华东师范大学生命科学院,上海 200062; 1上海市血液中心，上海 200051

　　【摘要】人类血小板同种抗原(human platelet alloantigens, HPA)是由血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性(SNP)。HPA可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，与输血后血小板减少性紫癜(PTP)、血小板输注无效(PTR)，新生儿同种免疫血小板减少性紫癜(NAITP)及移植排斥密切相关。因其在临床输血实践及相关疾病中的重要作用，而备受关注。本文就HPA抗原的命名、血小板糖蛋白多态性、HPA检测方法、血小板同种免疫反应机制以及相关疾病研究进展作一综述。

　　【关键词】 HPA; 血小板糖蛋白复合物多态性; 检测方法

　　Advances in the Studies on Human Platelet Alloantigen —— Review

　　HUANG Hui， FENG Ming-Liang, LIU Da-Zhuang　School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China; 1Shanghai Blood Center, Shanghai 200051, China

　　AbstractHuman platelet alloantigens (HPA) are specific antigens carried by platelet glycoproteins, which genes showing single nucleotide polymorphism. HPA can induce alloantibodies bringing about alloimmune response. They play important roles in post-transfusion refractoriness to platelets, post-transfusion thrombocytopenic purpura, fetomaternal alloimmune thrombocytopenia, and graft-versus-host disease. Because of their side effects in clinical blood-transfusion, there were a great deal of studies on HPA during last few decades. This review focuses on the nomenclature of HPA, the polymorphisms of platelet glycoproteins, HPA typing of the serological and molecular technology, as well as the mechanism of alloimmunization to HPA and correlated diseases.

　　Key wordsHPA; platelet glycoproteins polymorphisms; detection method

　　人类血小板同种抗原(human platelet alloantigen, HPA)是分布在血小板糖蛋白上一类特异性抗原，又称血小板特异性抗原。在目前已检测出的24 个HPA 抗原中,除HPA-14bw基因是因核苷酸1909到1911位置上AAG 3 个碱基缺失产生外,其他的HPA基因均具有单核苷酸多态性(SNP)[1] 。HPA可介导同种抗体的产生，引起同种免疫反应，引发同种免疫性血小板减少，如输血后血小板减少性紫癜(PTP)、血小板输注无效(PTR)及新生儿同种免疫血小板减少性紫癜(NAITP)，同时在临床移植中，还会引起移植排斥等相关的疾病。准确检测和鉴定HPA，对于临床医学和输血实践具有重要意义。

　　血小板抗原

　　血小板表面具有复杂的血型抗原，如ABO和一些多糖抗原，在输血中起重要作用。通常血小板抗原可分为两大类：一类是血小板相关抗原，与其他细胞表面或组织共有的抗原，主要与红细胞的ABO血型系统以及HLA有关;另一类是血小板特异性抗原，由血小板特有的抗原决定簇组成，表现血小板独特的遗传多态性，只在血小板和巨核细胞上表达。先前被看作是“血小板特异性”的血小板同种抗原也存在于其他细胞或组织上[2]。

　　血小板特异性抗原

　　人类血小板同种抗原(HPA)是通过相应抗体的检出而发现的，它具有独特的型特异性，血小板特异性抗原都分布在血小板糖蛋白上，构成血小板膜结构中的一部分[3]。血小板特异性抗原属于双等位共显性遗传系统，HPA多态性分布存在种族差异[4]。

　　命名法则

　　1959年，Van Loghem等[3]在多次输血的妇女血清中，发现Zwa，这是第一个被鉴定的人类血小板抗原。随后，人类血小板抗原的研究开始。20世纪60年代到90年代，Ko, Bak,Yuk,Gov,Mo,Max相继被发现。1990年，为避免新旧血小板抗原名称的混淆，国际血液学标准化委员会、国际输血协会(ISBT)血小板血清学研讨会决定，在系统前冠以HPA，即表示人类血小板特异性抗原。2003 年，由国际输血协会( ISBT) 和国际血栓和止血协会( ISTH) 联合成立的血小板命名委员会(PNC) ,对HPA 进行了系统命名,建立了命名原则和认可新抗原的标准。至今，使用血清学方法已检出24 个血小板抗原，其中Vaa和Moua抗原尚未达到国际命名要求,其余22 个抗原已被PNC 正式命名(见附表)。HPA命名原则是以HPA加数字表示。在共显性双等位基因的遗传系统中, a表示基因频率大于50 %的等位基因, b表示基因频率小于50 %的另一等位基因。若其中一个等位基因尚未被发现,则在数字后加w [5]。目前已知的系统有6对： HPA-1-HPA-5，HPA-15。24个抗原主要分布在糖蛋白GPⅡb，GPⅢa，GPⅠb，GPⅠa以及CD109上，具体分布情况及其单核苷酸多态性见附表。血小板糖蛋白复合物及其多态性

　　糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物多态性

　　GPⅢa(CD61， β3)是1个90 kD的单链蛋白，由3个结构域组成： ①由28个二硫键高度交叉连接的细胞外区域;②跨膜结构域;③短的细胞质化的片段。GPⅡb(CD41， αⅡb)是跨膜蛋白，细胞外116 kD的重链，通过二硫键与22 kD的轻链共价结合。GPⅡb/Ⅲa复合物是由α和β非共价结合组成的异二聚体整连蛋白(见图)。GPⅡb和GPⅢa糖蛋白分别由位于第17号染色体长臂上的ITGA2B和ITGB3基因所编码。GPⅡb上携带 HPA-3和　　HPA-9bw; GPⅢa携带9种HPA抗原，分别为HPA-1，HPA-4，HPA-6bw，HPA-7bw，HPA-8bw，HPA-10bw，HPA-11bw，HPA-14bw，HPA-16bw [6](见附图)。 Table . Human platelet alloantigens(略)

　　糖蛋白GPⅠb/V/Ⅸ复合物多态性

　　糖蛋白GPⅠb/V/Ⅸ复合物(CD42, von-Willerbrand因子受体)有4个跨膜组分： GPⅠbα(CD42b， 143 kD)与GPⅠbβ(CD42c， 22 kD )由1个二硫键共价连接;GPⅨ(CD42a， 20 kD)和GPV(CD42d， 83 kD)非共价结合。以上4种糖蛋白都是富含亮氨酸重复序列的蛋白家族成员。编码GPⅠbα的基因GP1BA位于第17号染色体上，编码GPⅠbβ的基因GP1BB位于第22号染色体上;编码GPV和GPⅨ的基因均位于第3号染色体上。GPⅠbα携带HPA-2(见附图);GPⅠbβ携带HPA-12bw;GPV和GPⅨ无多态性[6]。

　　糖蛋白GPⅠa-Ⅱ a复合物多态性

　　GPⅠa是一条165 kD的α2链，GPⅡa是一条145 kD的β1链(见附图)。GPⅡa，又称PECAM-1，糖蛋白GPⅠa-Ⅱ a(CD49/CD29，α2β1)复合物也存在于活化的T淋巴细胞和几类其他类型的细胞中。α和β链与胶原蛋白的结合依赖Mg2+。GPⅠa/Ⅱa中，只有GPⅠa有多态性，编码的GPⅠa基因ITGA2位于第5号染色体上，GPⅠa携带 HPA-5和HPA-13bw [6](见附图)。

　　CD109糖蛋白

　　CD109糖蛋白位于活化的血小板和T细胞上，编码基因位于第6号染色体上。CD109糖蛋白是与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的单聚体，约170 kD，是α2巨球蛋白/C3，C4，C5含硫代酯蛋白家族的成员[7]，CD109糖蛋白携带HPA-15(Gov)，具有两个等位基因(HPA-15a，HPA-15b)，HPA-15突变遗传因子是由A-C单核苷酸多态性反映的，A-C单核苷酸取代发生在CD109 cDNA的编码区2108位点，使CD109的第682位氨基酸发生Tyr/Ser替代[8] (见附图)。

　　HPA抗原检测方法

　　血清学方法

　　血小板免疫荧光试验(PIFT) 1978年，Von-den Borne等[9]发明了PIFT。该法用待测血清孵育已知血小板，洗涤，再与荧光物标记的抗球蛋白反应后洗涤，在荧光显微镜下观察结果。该法是较为可靠的血小板定型方法,1986年被国际血小板血清学研讨会确定为标准的参考方法。

　　流式细胞术 ( FCM )1986年,Rosenfeld等[10]发明了此技术。该法将待测血清和荧光标记的已知型别的血小板抗体孵育后，用流式细胞仪检测[11]。FCM用于免疫性血小板减少症患者的血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测,具有灵敏、快速、简便的特点,是适用于临床诊断的新方法[12]。

　　单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法(MAIPA) 1987年，Kiefel等[13]建立了单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法，是目前使用最为广泛的方法。该法先制备羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的HPA-5抗原，也能检测出。MAIPA方法可灵敏地检测血小板特异性抗体。

　　简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA) 1993年，由刘达庄等[14]发明。该法以抗人IgG抗体致敏红细胞为指示细胞，直接指示固相血小板抗原抗体免疫反应，检测血小板抗体[11]。若血小板上存在抗体，则指示细胞呈扩散分布，为阳性;若无抗体，则指示细胞聚集在底部，呈扣状，为阴性。该方法操作简单，微量，重复性、特异性和敏感性均较理想，固相化的血小板及抗IgG指示细胞能长久保存备用，可开展大量样本的检测工作[3]。

　　单克隆抗体酶联免疫吸附试验该法用多聚甲醛固定抗血小板糖蛋白单克隆抗体后，加入待测血清，最后加辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG，用底物邻苯二胺(O-phenylene diamine OPD)显色[11]。

　　放射免疫沉淀放射免疫沉淀使用放射性同位素标记的血小板膜蛋白，与受检血清结合，电泳分离后采用自身显影原理检测是否存在血小板抗体[1]。

　　基因分型方法

　　聚合酶链式反应序列特异引物分型技术(PCR-SSP) 1993年,Metcalfe等[15]首次运用序列特异性引物PCR成功地对HPA-1进行分型。SSP-PCR的原理：设计特异性引物，利用引物3'端的特异性，直接扩增相应的HPA片段，PCR产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。特点： SSP-PCR操作比较简单，耗时较少，适合小批量标本，是目前HPA基因定型中最常用的一种技术。

　　实时定量PCR(real-time quantitative PCR) 实时定量PCR原理：在PCR指数扩增期间，利用连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[16]。它广泛应用于定量检测mRAN表达水平，其特点是易操作、高通量、敏感性高和特异性强。最近， Ficko等[17]运用实时定量PCR技术分析了血小板糖蛋白GP-Ⅲa 基因的表达。 TaqManTM技术是美国Perkin Elmer 公司研制的一种实时PCR 技术[18],它利用了Taq多聚酶的核酸酶活性。Taq酶在引物延伸过程中，特异性移去杂交的探针，利用其5′核酸酶活性将探针劈开，释放出指示荧光染料，指示染料的荧光强度随着每一个扩增循环而增加。这一方法成功运用于HPA-1、-2和-3基因定型[19]。 2000年，美国Applied Biosystems公司开发了一种新的TaqMan-MGB[20]，进一步加强了Taqman SNP检测的能力。

　　基因芯片技术(DNA microarray) 基因芯片技术利用正向杂交的方法，制成针对HPA基因SNP位点的DNA芯片;用荧光标记的HPA 型特异性探针分别与芯片进行杂交，用软件分析样品的杂交结果，从而确定样品的HPA基因型。此技术特点是一次性可同时检测大量样品，快速，准确。近来， Brès [21]等用基因芯片对HPA-1等位基因系统分型，证明此方法适用于HPA基因分型。

　　限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP) 限制性片段长度多态性分析(RFLP)原理是：限制性内切酶能够识别DNA序列上的特异性位点，并切割产生一定长度的DNA片段。相关基因片断用含SNP区域的引物进行扩增，扩增产物用一种限制性酶进行降解，酶解的PCR产物进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，最后在紫外线下进行DNA片断的带型分析[22]。该法特点是RFLP是利用限制性内切酶酶解相应位点扩增产物，不需探针杂交，但被测的HPA基因需有合适的限制性酶切位点。

　　聚合酶链式反应-等位基因(序列)特异性寡核苷酸杂交(PCR-ASO)1990年,Lyman 等[23]发明了聚合酶链式反应-等位基因(序列)特异性寡核苷酸(PCR-ASO)技术。该方法用PCR扩增SNP的基因序列，扩增产物连接到尼龙膜支持物上，再与标记的等位基因特异性的指示物-寡核苷酸探针杂交。该方法特点是以杂交为基础的检测技术，但需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。

　　同源双链优先形成试验(PCR-PHFA)同源双链优先形成试验(PHFA)原理：双标记扩增产物(标准双链DNA，它的两条链分别被生物素和邻苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate, DNP)标记与未标记的待测DNA双链之间杂交时的竞争[24]。该方法特点：不需要电泳，可用软件进行结果判读。

　　单链构象多态性分析(PCR-SSCP) 单链构象多态性(SSCP)分析是Orita等[25]发明的，其原理是单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与其分子大小和三级构象有关,以此来检测基因变异和多态性。

　　血小板抗原同种免疫的反应机制

　　HPA可诱导受血者体内产生一系列同种免疫反应。通常有两种反应途径：直接途径和间接途径。直接途径中，受血者CD4+ T细胞上的T细胞受体直接与外源HPA同种抗原决定簇反应。供体抗原呈递细胞表面的MHCⅡ类分子呈递外源HPA同种抗原决定簇。间接途径中，外源HPA同种抗原决定簇被受体抗原呈递细胞加工后，受体CD4+ T细胞上的T细胞受体识别受体自身的抗原呈递细胞表面MHCⅡ类分子呈递的外源HPA同种抗原决定簇。 在这两种途径中，CD4+ T细胞活化需要充分的共刺激因子。CD4+ T细胞分泌的细胞因子，如白介素-2和干扰素家族，可刺激初始B细胞发育为分泌抗体的浆细胞。直接识别途径是一个强而快的反应，它可激起整个TCR受体库中5%的受体。间接识别途径中，活化的CD4+ T细胞减少了约99%，但若给予与直接途径相同的滴定量，能产生等量的抗体[6]。 血小板糖蛋白是免疫识别和免疫攻击的靶，通常被自身或同种异基因效应T细胞和B细胞所识别。在上述两种情况下，最终的反应是巨噬细胞Fc受体与免疫球蛋白分子的Fc片段结合后，血小板被巨噬细胞吞噬，这通常发生在脾中[26]，引起血小板减少症。自身免疫的作用靶通常是非多态性的血小板糖蛋白和磷脂。同种免疫反应通常是由MHC-I类分子和糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，GPⅠb/V/Ⅸ，GPⅠa-Ⅱa，GPⅣ上的同种抗原引起的，在临床上引发NAITP，PTP，PTR。

　　HPA与临床相关疾病

　　新生儿同种免疫性血小板减少症(NAITP)

　　NAITP是因胎儿与母亲的血小板血型不合，而使母亲产生同种抗体，同种抗体通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿的血小板特异性抗原发生反应，导致胎儿和新生儿血小板减少。基于胎儿和母亲之间不同的免疫基因，血小板抗体在怀孕期就产生了。通常这些抗体是抗HLA-Ⅰ 类分子以及少数的抗HPA。在15%-30%怀孕的妇女中发现有HLA抗体，但不表现出因胎盘的免疫防御机制而造成严重威胁[27]。曾报道，HPA同种抗原在怀孕期的免疫识别是HLA限制性的。具有HLA-DR52a(DR133*0101)等位基因的HPA-1a阴性妇女，敏感地与胎儿的HPA-1a抗原反应，说明HPA-1a与HLA-DR52a之间可能存在高度关联 [28]。在HLA-DR6单体型的孕妇中，可能存在HPA-5b同种免疫应答类似的联系[29]。调查显示，大多数NAITP是由HPA-1a同种抗体引起的;其次是HPA-5b，近来也有报道HPA-15不合也会导致NAITP[30]。治疗措施主要是给患者输入母体中同种抗体无反应性的血小板，或对患儿进行换血治疗。预防方法主要是对母亲作血浆置换治疗。

　　输血后紫癜(PTP)

　　输血后紫癜通常是在输全血或血小板后发生的，绝大多数为女性。在输血后的6-10天，血小板数量减少，严重者有内脏和颅内大出血。输血后紫癜主要由HPA-1a引起的(占80%-90%)，HPA-1b，HPA-3b，HPA-15也会引起PTP。Taaning[31]等发现，在血小板减少症阶段，IgG和IgM家族的特异性抗体，特异性地攻击血小板GPⅡb-Ⅲa，GPⅠb-Ⅸ，GPⅠa-Ⅱa，与HPA同种抗体同时形成，这些短暂的反应抗体可能是PTP中血小板破坏的原因。 治疗方法：血浆置换，同时输注"配合"的浓缩血小板，患者的血小板计数会回升。

　　血小板输注无效(PTR)

　　血小板输注无效是由于患者反复输注血小板而产生了血小板同种抗体，导致再次输入血小板时，发生免疫反应。主要是由血小板HLA抗原(HLA-A，-B，-C)以及少数HPA抗原引起的，重复输注的血液成分中含有白细胞，HLA抗体在所有病人中达到50%-90%，同时，也有17%-25%的HPA抗体出现，缩短输注血小板的寿命[32]。在日本人中HPA-2b是引起血小板输注无效的主要原因之一。治疗方法：输注"配合"的浓缩血小板。

　　移植排斥

　　在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相关排斥反应的原因之一。骨髓移植是治疗白血病的最佳方案，其成功率由供者与受者之间HLA配合程度决定。尽管供者与病人的HLA完全相配，仍有近25%的骨髓移植中，会发生移植物与宿主之间的排斥反应。这些现象是由供者与受者之间不同的次要组织相容性抗原引起的。次要组织相容性抗原是细胞内多态性肽段，结合在HLA分子的沟槽内，呈递给CTLs，导致移植排斥或GVHD [33]。虽大多数mHA已被鉴定，但在临床上HLA相配的骨髓移植中，仅HA-1错配被证明是与GVHD反应相关[34]。 HPA同种抗原具免疫原性，且分布比想象中更为广泛，故可推测，在骨髓移植中，HPA抗原起次要组织相容性抗原的作用。Balduini等[35]在70例临床HLA相配儿童的骨髓移植中，研究了HPA-1，-2，-3和-5的相容性。他们推测：当受者从HLA相配的供者上移植骨髓时，HPA-3同种抗原可作为mHA起作用。 Kekomaki等[36]首次报道了HPA同种抗原在器官移植中的作用。近年来，Kekomaki等[37]进行的研究，部分地证实了HPA-5同种抗原在移植中的作用。他们对比地研究了166对肾脏移植-受体的HPA-1，-2，-3，-5的相容性。获得的结果表明，当HPA-5a/5a病人接受 HPA-5b阳性供者的肾时，HPA-5b作为次要组织相容性抗原在急性血管排斥反应中起作用。

　　结语

　　研究血小板HPA同型输注;准确判定胎儿的HPA抗原，对新生儿进行筛查，以预防NAITP的发生;避免因HPA不合而产生移植排斥反应;研究建立已知HPA型供者库等，这些都将是今后研究的热点。对HPA抗原的研究将有助于避免同种免疫造成的血小板输注无效发生，从而为血液的安全输注提供保障;而逐步建立HPA和HLA型已知型的血小板供者库，则有利于选择匹配型血小板输注，达到快速、有效的急救输血目的。

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　　基金项目：上海市医学重点学科-安全输血(编号 05Ⅲ003)及上海市自然科学基金资助课题(编号 05ZR14107)