非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究

　　作者：刘元华, Christophe Leboeuf, 金晓龙,肖家诚, Anne Janin, 陈赛娟，赵维莅 作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海血液学研究所，医学基因组学国家重点实验室，上海 200025;1U728，法国国立卫生研究所/法国巴黎第七大学，巴黎 75010;2上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科，上海 200025;基金项目：上海市科委国际合作项目(编号44107025);中法先进研究计划(编号B05-02);上海市科委启明星计划(编号05QMX1429)

　　【摘要】 本研究探讨78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表达和突变的发生率及其临床意义。应用激光微切割技术从淋巴结组织中特异地分离淋巴瘤细胞，用实时定量RT-PCR法检测淋巴瘤组织和淋巴瘤细胞中BCL-XL的表达，PCR直接测序法检测BCL-XL的突变情况。结果表明：与淋巴结反应性增生(15例)相比，滤泡性淋巴瘤(30例)组织和微切割的淋巴瘤细胞均高表达BCL-XL(P值分别为0.0064和<0.0001)，而T细胞淋巴瘤(24例)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(24例)中BCL-XL表达无明显升高。在滤泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表达的患者常伴多个淋巴结外器官累及(P=0.0004)，血清乳酸脱氢酶水平升高(P=0.0019)，国际预后指数分组多为高危组(P=0.0013)，患者总生存期短(P=0.0451)。突变检测发现1例滤泡性淋巴瘤BCL-XL的同义突变(密码子 109 ACA→ACC)。结论：BCL-XL表达与滤泡性淋巴瘤的疾病进展和患者预后密切相关。

　　【关键词】 非霍奇金淋巴瘤,BCL-XL基因,基因表达;基因突变

　　AbstractThe study was aimed to investigate the BCL-XL expression and mutation, and its clinical significance in non-Hodgkin′s lymphoma. Lymphoma cells were selectively isolated by laser microdissection. BCL-XL expression from lymphoma tissue and microdissected lymphoma cells was measured by using real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. BCL-XL mutation was analyzed by using direct sequencing of PCR products. The results showed that compared to 15 patients with reactive hyperplasia, BCL-XL was overexpressed in follicular lymphoma (n=30), both in lymphoma tissue (P=0.0064) and in microdissected lymphoma cells (P<0.0001). No significant rise of BCL-XL expression was observed in patients with T-cell lymphoma (n=24) and diffuse large B cell lymphoma (n=24). In follicular lymphoma, high BCL-XL level was associated with multiple extranodal involvement (P=0.0004), elevated lactate dehydrogenase level (P=0.0019), high-risk international prognostic index (P=0.0013) and a short overall survival time (P=0.0451). Mutation analysis revealed one synonymous mutation (Codon 109 ACA→ACC) in one case of follicular lymphoma patient. It is concluded that BCL-XL expression is closely correlated with progress of follicular lymphoma and prognosis of patients with follicular lymphoma. The value of BCL-XL expression as a prognostic marker in follicular lymphoma should be considered.

　　Key wordsNon-Hodgkin′s lymphoma; BCL-XL gene; gene expression; gene mutation

　　淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年来，非霍奇金淋巴瘤在世界范围内的发病率几乎增长了1倍，严重危害人类的健康[1]。 因而探索淋巴瘤的发病机制、掌握淋巴瘤的疾病进展相关基因，对于淋巴瘤的诊断治疗前景，特别是开展个体化诊治和基因靶向治疗具有重要意义。

　　凋亡异常对于恶性肿瘤的发生发展起着相当关键的作用。 凋亡受阻致使肿瘤细胞寿命延长， 异常堆积，最终引起细胞转化和肿瘤形成[2]。 同时，诱导凋亡又是肿瘤治疗，包括化疗药物治疗、放射治疗和免疫治疗的重要机制之一。凋亡抑制可使肿瘤细胞产生耐药，导致治疗失败或疾病复发[3]。细胞凋亡主要通过两个途径：外源性途径和内源性途径。后者起始于线粒体细胞色素C的释放，作用于凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1)，诱导caspase-9活化，导致细胞凋亡[2]。BCL-2家族在调节凋亡的内源性途径中起着重要作用，按其功能不同主要分为两类：一类是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一类是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等[4]。 在非霍奇金淋巴瘤中，内源性途径受抑也是影响肿瘤细胞凋亡的重要因素[5]。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X编码，后者位于20q11.21，由3个外显子组成。BCL-X缺陷的小鼠表现为幼稚淋巴细胞的凋亡明显增加，同时亦证实BCL-XL在淋巴瘤中表达[6，7]。然而，它在不同类型淋巴瘤中的表达情况和与疾病进展的关系尚缺乏系统的研究。本研究应用实时定量RT-PCR法检测78例患者淋巴瘤组织和细胞中BCL-XL的表达，应用PCR直接测序法检测是否存在BCL-XL突变，探讨BCL-XL的表达及基因突变在淋巴瘤发生发展中的意义。

　　材料和方法

　　患者

　　患者共78例, 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院和法国巴黎第七大学圣路易医院，其中男38例，女40例，年龄21-88岁，中位年龄52岁。按WHO病理分型，78例中T细胞淋巴瘤24例，弥漫性大B细胞淋巴瘤24例，滤泡性淋巴瘤30例。对照组为淋巴结反应性增生患者，共15例。两组均经患者知情同意后，留取部分淋巴结活检组织，-80℃冻存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作为基因突变检测对照。

　　激光微切割

　　用淋巴结冷冻组织制备7 μm切片，70%酒精固定，苏木素-伊红染色。应用激光微切割仪(LEICA公司产品)切割约1 500个淋巴瘤细胞，自动置入TRIzoL中，用于RNA提取。

　　DNA提取

　　按常规酚-氯仿抽提，冷无水乙醇沉淀法提取基因组DNA[8]，最后溶于适量TE中。紫外分光光度计测定样品DNA含量。

　　RNA提取

　　淋巴结组织总RNA经制备10-15片10 μm冰冻组织切片后提取，淋巴瘤细胞总RNA直接从激光微切割的细胞中提取，操作参照TRIzoL试剂盒说明书进行。

　　cDNA合成

　　通过逆转录反应将RNA 转化为cDNA。25 μl逆转录体系包括： 5×逆转录缓冲液5 μl;dNTP 5 μl;Oligo-dT 2 μl;逆转录酶MMLV(Promega公司产品) 1 μl;RNasin 0.5 μl，淋巴结组织模板为1 μg总RNA，激光微切割的淋巴瘤细胞模板为所有微切割产物提取的总RNA产物。反应条件：42℃ 60分钟，90℃ 5分钟，4℃保存。

　　实时定量PCR

　　BCL-XL和TBP(human transcription factor IID/TATA binding protein)的TaqMan定量PCR试剂购自PEApplied Biosystems公司，通过ABI PRISM 7700定量PCR仪检测。TBP作为内参校正样本量，同时将表达BCL-XL的Jurkat细胞系[9]作对照。定量PCR结果参照2(-ΔΔCT)法计算[10]，所示数值为每个标本BCL-XL表达量和Jurkat细胞BCL-XL表达量的比值。

　　PCR直接测序

　　采用Taq酶(购自申友公司)通过PCR法扩增BCL-XL各目的片段。PCR 反应体系为25μl。扩增条件：预变性94 ℃ 5分钟;循环条件为94℃变性30秒, 退火温度为54-60℃(根据各引物不同而改变), 退火时间为30秒，72℃延伸50秒，共35个循环;72℃ 7分钟。扩增启动子区与外显子的引物序列如下：启动子区上游引物：5′ TGCGGGGATGCCGGTAACTC 3′;下游引物：5′ GCCTCACCCTCACCCAGTCT 3′ ;1号外显子上游引物：5′ TAATAGGGATGGGCTCA ACC 3′;下游引物：5′ CTTCGCAATTCCTGTGT CGC 3′;2号外显子上游引物：5′ AAGAAAAGGGA CACACAAGG 3′;下游引物：5′ TGAGTGAGCAG GTGTTTTGG 3′;3号外显子上游引物：5′ ATACCT GCCAGCCTCCTTTG 3′;下游引物：5′ TTTCCCC ACCCACCTACATC 3′。

　　PCR产物纯化测序

　　采用虾碱酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)和外切酶(exonuclease I)纯化PCR产物。反应体系：4 μl PCR产物(30 ng/μl);0.5 μl SAP(3.3 U/μl);0.5 μl Exon 1(20 U/μl);用ddH2O定容至10 μl。反应条件：37℃ 60分钟，80℃ 15分钟。纯化产物经电泳定量，将浓度调整至10 ng/μl后采用ABI 3700自动测序仪(PE Biosystems公司)进行直接测序。

　　统计学分析

　　数据以均数±标准差(X±SD)表示，使用t检验分析。患者随访截止期为2005年6月，总生存期(OS)即患者从诊断到死亡或随访截止期的时间。生存分析按照Kaplan-Meier法进行，应用Log-rank和χ2检验，P值小于0.05具有统计学意义。所有处理均用SAS 8.2统计软件完成。

　　结果

　　非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表达

　　与反应性增生淋巴结相比，滤泡性淋巴瘤组织的BCL-XL表达显著升高(P=0.0064)，而在T细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤与之相比无显著差异(表1)。Table 1. BCL-XL Expression in Non-Hodgkin′s Lymphoma (略)

　　滤泡性淋巴瘤细胞表达BCL-XL

　　运用微切割技术从滤泡性淋巴瘤组织切片中直接分离淋巴瘤细胞，运用定量PCR法检测BCL-XL表达。结果表明，与反应性增生的淋巴细胞相比(2.79±0.59)，微切割的滤泡性淋巴瘤细胞高表达BCL-XL(9.00±4.26，P<0.0001)。

　　滤泡性淋巴瘤BCL-XL表达与疾病进展和患者预后相关

　　在滤泡性淋巴瘤中，具有多发淋巴结外浸润、血清乳酸脱氢酶水平升高和国际预后指数分组(international prognostic index, IPI)为高危组的患者BCL-XL表达显著升高(P值分别=0.0004、0.0019和0.0013)(表2)。在T细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中无上述差异。Table 2. BCL-XL gene expression of follicular lymphoma patients in relation to clinical characteristics(略)

　　根据淋巴结反应性增生组BCL-XL的平均值(3.13)将滤泡性淋巴瘤患者分组，BCL-XL相对高表达的患者(>3.13，A组，n=20)2年和5年OS分别为94.74%和43.21%，显著低于BCL-XL相对低表达的患者(<3.13，B组，n=10，2年和5年OS 均为100%，P=0.0451)(图1)。在T细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤中，BCL-XL表达与患者生存无显著相关。

　　BCL-XL基因突变分析

　　运用PCR产物直接测序法，我们在78例非霍奇金淋巴瘤中发现1例滤泡淋巴瘤的BCL-XL基因伴不改变氨基酸的同义突变密码子109 ACA→ACC(图2)，突变发生率为1.28%,与NCBI 的SNP 数据库和60例正常人比较后未见相同的变异。

　　讨论

　　细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发所引起的细胞主动死亡过程，在细胞增殖和肿瘤发生等过程中起着十分关键的作用。然而，凋亡的调控基因根据肿瘤类型的不同而有所改变。与侵袭性较高的T细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤相比，低度恶性的滤泡性淋巴瘤中高表达BCL-XL，说明凋亡异常在“惰性”淋巴瘤中的重要性[5]。淋巴瘤组织中除淋巴瘤细胞以外，还包含炎性细胞，基质细胞以及正常细胞，后者可能影响基因研究的特异性和敏感性。本研究中，我们通过激光微切割技术直接选取了滤泡性淋巴瘤细胞进行定量PCR检测。结果表明，微切割的淋巴瘤细胞与反应性增生的淋巴细胞相比，前者BCL-XL表达的水平更高，这进一步证实了高表达的BCL-XL是滤泡性淋巴瘤细胞本身表达的。与BCL-2相似，BCL-XL可稳定线粒体膜通透性，通过减少凋亡因子的释放而抑制细胞凋亡。然而，BCL-XL除与BCL-2具有相同的抑制细胞凋亡的作用外，还可在功能上替代后者，挽救因BCL-2缺失而致的淋巴细胞凋亡，这在BCL-2-/-的BCL-XL转基因小鼠中已被证实[11]。 同时在高表达BCL-2的滤泡淋巴瘤细胞中，下调BCL-XL的表达，淋巴瘤细胞将随之发生凋亡[12]。 因此，BCL-XL是影响滤泡性淋巴瘤细胞凋亡的关键因素[13]。深入的研究表明，BCL-XL高表达与患者的疾病进展密切相关。肿瘤细胞凋亡受抑，浸润各脏器，表现为诊断时即具有多处淋巴结外累及;同时肿瘤负荷增加，表现为血清乳酸脱氢酶升高;相应地，患者的国际预后指数分期多位于高危组。更重要的是，已知BCL-XL可抑制CD40和化疗药物介导的肿瘤细胞的凋亡[14，15]，BCL-XL高表达的患者预后不良，这从另一角度反映了肿瘤细胞的耐药性。 为探索其异常表达的机制，我们检测了BCL-XL的突变情况。结果在78例非霍奇金淋巴瘤仅发现1例滤泡淋巴瘤存在突变，但为同义突变，不改变氨基酸序列。Yamaguchi等[16]在50例非霍奇金淋巴瘤中也仅发现1例弥漫性大B细胞淋巴瘤有BCL-XL突变。因此，BCL-XL在淋巴瘤细胞中具有高度保守性，其表达上调的原因有待于进一步研究。综上所述，BCL-XL的异常表达在滤泡性淋巴瘤发生进展中具有一定的作用，可作为滤泡性淋巴瘤一个重要的预后指标和基因治疗靶点。

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