K562细胞外泌体诱导特异性CTL生成的研究

　　作者：陈绍倩,杜英,王鑫,顾巧丽,黄玉敏,董子　　作者单位：郑州大学第一附属医院血液科 ， 郑州 450052; 郑州大学基础医学院， 1免疫教研室; 2病理生理教研室，郑州 450052

　　【摘要】为了研究人白血病细胞株K562细胞分泌的外泌体(exosomes)及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞(DC)分泌的外泌体能否诱导出K562细胞特异性CTL，采用四步离心法提取K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的培养上清液中的外泌体，并诱导CTL生成，以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL 对K562细胞的杀伤作用。结果显示：K562细胞外泌体和K562细胞RNA刺激的DC和外泌体均能明显促进对K562细胞的杀伤活性，与未经外泌体作用的对照组相比有显著性差异(P<0.05)。外泌体作用后对K562细胞的杀伤作用明显比对HL-60细胞的杀伤作用强，其差异有显著性(P<0.05)。结论：K562细胞外泌体能够诱导出特异性抗白血病细胞的免疫反应。

　　【关键词】 K562细胞;树突状细胞;外泌体;细胞毒T淋巴细胞

　　AbstractThe aim of this study was to investigate whether exosomes derived from K562 cells and human monocyte-derived dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of K562 cells are capable of inducing antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses in vitro. DCs were generated from peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of healthy volunteers in the presence of GM-CSF and IL-4, and then were transfected with K562 RNA by using DOTAP lipofection. Exosomes was extracted from the supernatant of DCs and K562 cells. The T cell were activated to be tumor specific CTL after DCs and exosomes were co-cultured with autologous T cells derived from healthy volunteers′ PBMNC. The effect of CTL on K562 cells was detected by MTT assay. The results showed that treatment of T cells with exosomes derived from K562 cells or DCs transfected with total RNA of K562 cells could significantly promote their killing ability on K562 cells as compared with untreated T cells (P<0.05). The killing ability of T cells treated with exosomes on K562 cells was stronger than on HL-60 cells (P<0.05). It is concluded that the specific CTL immune response to leukemia cells can be induced by exosomes derived from K562 cells.

　　Key wordsK562 cell;dendritic cell;exosome;cytotoxic T lymphocyte

　　外泌体(exosome)是一种直径在50-90 nm的亚细胞双层膜颗粒,抗原呈递细胞衍生的外泌体携带有丰富的抗原呈递所需要的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子和热休克蛋白等分子;肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相关抗原，能诱导肿瘤相关抗原的特异性CTL反应，是一种有效的抗原转运呈递载体[1,2]。Zitvogel等[3]的动物体内实验结果显示，用实体肿瘤抗原冲击树突状细胞(DC)，其外泌体可以诱发荷瘤小鼠的肿瘤排斥效应。Morse等[4]的一期临床实验用非小细胞肺癌MAGE-A3或A4抗原冲击进展期非小细胞肺癌患者(MAGE抗原阳性)自体树突状细胞，获得DC衍生的外泌体，这种携带MAGE肿瘤抗原的DC衍生的外泌体可以诱导MAGE特异性T细胞反应并使一部分病人的病情得到缓解和控制，提示DC衍生的外泌体可以作为无细胞治疗性肿瘤疫苗用于肿瘤的免疫治疗。外泌体在实体肿瘤方面的研究报告较多，而在白血病方面的报告却甚少，因此我们提取了白血病细胞株K562细胞及K562细胞总RNA刺激人树突状细胞的外泌体，观察了其诱导的抗白血病细胞的作用，发现其外泌体能诱导K562细胞特异性CTL，现报告如下。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　标准胎牛血清、淋巴细胞分离液(TBD公司产品); rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2(Peprotech公司产品);完全培养基RPMI 1640(Gibco公司产品);小鼠抗人MHC-I、 MHC-II、CD54(ICAM-I)、CD86(B7-2)、CD80(B7-1)、CD40单克隆抗体(Ancell公司产品);胶体金标记马抗小鼠IgG(华美公司产品)。二甲亚砜、四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司产品);TRIzoL试剂(Invitrogen公司产品);DOTAP脂质体(Roche公司)。

　　细胞株培养

　　K562细胞株 和HL-60细胞株系郑州大学基础医学院保存株。K562和HL-60细胞于含10% 的胎牛血清 (56℃灭活30分钟) 、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、5×10-5mol/L 2-巯基乙醇和1×10-3 mol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2培养箱中培养。

　　K562细胞总RNA制备

　　按照TRIzoL试剂说明书抽提处于对数生长期的K562细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，紫外分光光度仪测定A260和A280数值。

　　DC的诱导和培养

　　从正常人外周全血细胞获得贴壁细胞，调整浓度至5×105/ml，悬浮培养于RPMI 1640完全培养液中，分别加入终浓度为100 ng/ml rhGM-CSF和500 U/ml rhIL-4, 隔天半量换液，补充新鲜培养液及细胞因子以诱导生成DC。取上述制备的K562细胞总RNA (25 μl /250 μl Opti-MEM)和DOTAP (50 μl /250 μl Opti-MEM)各250 ml，室温下在聚苯乙烯试管中混合20分钟,混合物加入培养5天的DC，在37℃培养箱孵育4小时。4小时后吸出培养上清,加入含rhGM-CSF和rhIL-4的RPMI 1640完全培养液继续培养。

　　外泌体的提取

　　取对数生长期的K562细胞和K562细胞总RNA刺激的DC的培养上清，按文献外泌体4步离心法分离[5,6]，即：4℃ 300× g离心10分钟; 1 200 ×g离心30分钟;10 000× g离心30分钟;最后，100 000× g 超速离心60分钟，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS将外泌体，100 000×g超速离心60分钟，洗1遍后，用PBS 100 μl重悬,用BCA法进行定量，低温保存备用。

　　K562细胞外泌体刺激DC诱导CTL的生成

　　外周血非贴壁细胞过尼龙毛柱获得T细胞，加入IL-2(终浓度5×105 U/L)培养扩增。上述外周血DC培养5天后分组，一组加入终浓度为20 μg/ml的K562细胞外泌体与DC共孵育24小时作为实验组DC，另一组不加外泌体继续培养24小时作为对照组DC。将实验组和对照组的DC和T淋巴细胞按1∶20混合，继续培养3天诱导CTL生成，然后加入靶细胞K562细胞和HL-60细胞，效靶比为20∶1，MTT法测2组T细胞对K562细胞和HL-60细胞的杀伤活性[7]。

　　CTL杀伤活性 =[靶细胞对照组A值-(实验组A值-效应对照组A值)/靶细胞对照组A值]×100%。

　　RNA刺激的DC及外泌体诱导CTL的生成

　　取第7天K562细胞总RNA刺激DC(实验组DC)和未刺激DC(对照组DC)，同上述方法诱导CTL生成，并测2组T细胞对K562细胞的杀伤活性。取RNA刺激的DC和未刺激的DC分泌的外泌体各10 μg/ml，分为2组：未刺激DC分泌外泌体组(对照组)和 RNA刺激DC分泌 外泌体组(实验组)，诱导CTL生成，用上述方法测各组对K562细胞的杀伤活性。

　　统计学分析

　　实验数据以X±SD表示，应用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，采用χ2检验，以a = 0.05为检验水准。

　　结果

　　外泌体、RNA和DC的鉴定

　　目前对外泌体的鉴定主要依赖形态学观察和蛋白组成分析。我们对从培养上清液中所提取的分离样品进行了电子显微镜超微结构的观察、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)蛋白带型的分析及标志性分子的Western胶体金免疫方法检测，结果表明我们的分离样品正是外泌体。同样也对所提取的K562细胞RNA做了琼脂糖凝胶电泳，用紫外分光光度仪测定其A260和A280数值，检测证明所提取的K562细胞RNA未降解。所诱导的DC在形态和标志性分子的表达测定也表明诱导出了典型的树突状细胞。

　　K562细胞外泌体诱导的CTL细胞杀伤活性

　　我们用常规四步离心法提取K562细胞培养上清液中的外泌体，后者作用于DC并诱导CTL生成，以K562细胞作为靶细胞，观察对其杀伤作用。在效靶比为20∶1和40∶1时，外泌体作用后诱导的CTL对K562细胞的杀伤率 (实验组)和外泌体未作用诱导的CTL(对照组)对K562细胞的杀伤率相比较，实验组杀伤活性明显增高(P<0.05)。外泌体作用后的CTL对K562细胞的杀伤率 (实验组)与对HL-60细胞的杀伤率相比较，外泌体作用后的CTL对K562细胞的杀伤率也明显增高(表1)，提示外泌体作用后的CTL对K562细胞的杀伤有特异性。这说明K562细胞外泌体作用于DC后诱导的CTL对K562白血病细胞有特异性杀伤活性。

　　RNA刺激DC及外泌体诱导的CTL生成

　　用RNA提取试剂盒提取K562细胞RNA，然后用提取到的RNA刺激正常人树突状细胞并提取后者培养上清液中的外泌体。分组检测RNA刺激DC(刺激DC为实验组，未刺激DC为对照组)和RNA刺激DC外泌体诱导的对K562细胞的杀伤活性(RNA刺激DC外泌体为实验组，RNA未刺激DC为对照组)。RNA刺激DC实验组诱导的杀伤活性和对照组比较，杀伤活性明显增高(表2)。同时用K562细胞RNA刺激正常人树突状细胞培养上清液提取到的外泌体直接刺激T淋巴细胞，诱导CTL生成(实验组)，后者对K562细胞的杀伤作用和未刺激对照组比较，也较明显增强，提示抗原荷载后的树突状细胞外泌体有直接诱导抗原相关的CTL杀伤白血病细胞的作用。

　　讨论

　　肿瘤的免疫治疗一直都是肿瘤研究的一大热点，从早期的IL-2、IFN、LAK细胞到近年的树突状细胞疫苗，逐渐地从非特异性向特异性靠近，取得了令人鼓舞的成绩[8-10]，但都存在这样或那样的不足，外泌体则为我们展示了一片新天地。近些年对外泌体的研究发现，不同细胞分泌的外泌体有着不同的生理作用。造血细胞，尤其是抗原呈递细胞衍生的外泌体携带有丰富的抗原呈递所需要的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子和热休克蛋白等分子，肿瘤细胞衍生的外泌体还携带有肿瘤相关抗原，是一种有效的抗原转运呈递载体，能直接或间接作用于树突状细胞、T细胞和NK细胞等，在体内发挥着免疫调节作用，而且体内作用效果更好，实体瘤方面的临床实验结果提示，外泌体有很大潜能作为一种新型疫苗用于肿瘤的治疗[3,4]。推测白血病细胞外泌体也有这种作用，因此我们研究了白血病细胞株K562细胞外泌体是否也能诱导出特异性杀伤K562细胞的免疫应答，白血病外泌体是否也有可能用于白血病的治疗，实验结果验证了我们的推测：白血病细胞外泌体可以诱导出特异性CTL免疫反应;同时我们的实验还证明，K562细胞RNA刺激的树突状细胞及外泌体也可以直接诱导出对K562细胞的杀伤活性，提示白血病细胞外泌体也有作为疫苗用于白血病治疗的极大潜能。外泌体可以长期保存，易于进行工业化生产标准的制定和质量控制，作为亚细胞结构，较之细胞疫苗具备更多免疫学优势，且目前临床级外泌体提取方法也已成熟[5]，临床上白血病细胞较实体瘤细胞更易获得，易于获得白血病细胞衍生的外泌体，因此可以考虑开展更多的研究包括合用免疫佐剂等以制备出更为高效和更为特异的外泌体疫苗。尽管外泌体用于临床治疗患者还有很多的工作要做，但我们认为外泌体还是为白血病患者带来了新的希望。

　　【参考文献】

　　1 André F, Schartz NE, Chaput N, et al. Tumor-derived exosomes: a new source of tumor rejection antigens. Vaccine, 2002; 20: A28-31

　　2 Zitvogel L, Fernandez N, Lozier A, et al. Dendritic cells or their exosomes are efective biotherapies of cancer. Eur J Cancer, 1999; 35(Suppl 3) : S36-S38

　　3 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med, 1998; 5: 594-600

　　4 MMorse MA， Garst J, Osada T, et al. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Transl Med, 2005; 21:3-9

　　5 Lamparski HG, Metha-Damani A, Yao JY, et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods, 2002; 270: 211-226

　　6 Sozzani S, Allavena P, D′ Amico G , et al. Differential regulation of chemokine receptors during dendritic cell maturation: a model for their trafficking properties. J Immunol, 1998;161:1083-1086

　　7 司图镇强，吴军正. 细胞培养. 西安;世界图书出版社，1996: 186-187

　　8 于松涛，何维. 树突状细胞接种——肿瘤免疫治疗的新策略.中国实验血液学杂志, 1997;5: 52-57

　　9 王鸿鹄,徐开林,潘秀英等. 抗原冲击致敏的树突状细胞介导的特异性体外抗慢性粒细胞白血病细胞作用.中国实验血液学杂志, 2003;11:278-281

　　10 陈虎,楼晓,江岷等. 树突状细胞介导的抗白血病效应的临床研究. 中国实验血液学杂志, 2005;13: 412-416