As2O3抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖及VEGF表达

　　作者：喻镁佳,段勇,刘华,张学美　　作者单位：云南昆明医学院第一附属医院血液科，1检验科，昆明 650031;基金项目：云南省教育厅基金资助项目，编号 04Z009C

　　【摘要】本研究探讨在As2O3作用下人淋巴瘤Raji细胞的增殖及VEGF mRNA表达的变化。采用改良MTT方法观察As2O3对Raji细胞的增殖抑制效应;采用半定量RT-PCR方法检测As2O3对Raji细胞VEGF121和VEGF165 mRNA表达的影响。结果表明：As2O3对Raji细胞的作用表现时间、剂量依赖性的增殖抑制效应，建立回归方程为：IR=0.531dose+0.481time(P<0.05)。半定量RT-PCR方法检测显示，Raji细胞同时表达VEGF121和VEGF165两种剪切变异体，二者的表达水平相当(VEGF1211.17±0.14;VEGF1651.31±0.19，P>0.05)。VEGF121和VEGF165 mRNA表达量与As2O3作用时间呈负相关关系(rsv121=-0.547，P<0.05;rsv165=-0.632，P<0.05)，且VEGF的各异构体对药物的反应具有差异性，VEGF165 mRNA表达下调早且有持续性。但在所选浓度组中未发现类似的相关关系(P>0.05)。结论：As2O3既可抑制Raji细胞生长增殖，亦可通过下调VEGF mRNA表达而产生抗血管新生效应，且小剂量、长时程给药时结果亦然。

　　【关键词】 三氧化二砷,淋巴瘤,血管内皮生长因子;血管新生

　　Abstract This study was aimed to investigate the effects of As2O3 on proliferation of B lymphoma Raji cell and to study the expression changes of VEGF mRNA. The modified MTT was adopted to evaluate the effect of As2O3 on proliferation of Raji cells. Semi-quantitative RT-PCR was used to detect the expression of VEGF121 and VEGF165 mRNA in Raji cells exposed to As2O3. The results showed that the As2O3 significantly inhibited the proliferation of Raji cells，the relationship between the inhibition rate and the concentrations of As2O3 was dose-and time-dependent. The VEGF121 and VEGF165 mRNA expressions were found in Raji cells，and both were well-matched in expression levels. After treatment of As2O3 at 1 μmol/L for 48 hours，the expression levels of VEGF121 and VEGF165 mRNA were significantly down-regulated and demonstrated negative corelation with the time of exposure to As2O3. Otherwise some difference were observed in effects of As2O3 on VEGF121 and VEGF165，the expression of VEGF165 mRNA was down-regulated earlyer and longer than that of VEGF121，while no similar correlation was found in selected concentration groups. It is concluded that As2O3 can significantly inhibit the growth of Raji cells and may exerted its anti-angiogenesis effects by down-regulating the VEGF mRNA expression even in a low concentration for a long term.

　　Key words arsenic trioxide; lymphoma; vascular endothelial growth factor (VEGF); angiogenesis

　　自从As2O3用于急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗以来，其良好的疗效和特异的作用机制已引起人们关注。多数研究认为诱导凋亡是As2O3的主要作用机制，但也有报道As2O3可下调慢性髓性白血病患者骨髓细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的表达[1]，因此As2O3的抗肿瘤机制中亦可能包含有抗血管生成效应。本研究在进一步观察As2O3对人淋巴瘤Raji细胞增殖活性影响的基础上，初步探讨其对淋巴瘤细胞VEGF mRNA表达的影响。

　　材料和方法

　　药物

　　As2O3(亚砷酸注射液，哈尔滨伊达药业有限公司产品，批号：20030801)5 ml∶5 mg，分子量：126，原液浓度8 mmol/L，使用时用无菌RPMI 1640培养液稀释至所需浓度。

　　细胞株的培养和传代

　　人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞(上海药物研究所惠赠)，接种于含15%灭活小牛血清的新鲜RPMI 1640培养液中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，视生长状况每2-3天对细胞换液传代1次，所有实验均用指数生长期细胞。

　　细胞增殖抑制试验

　　接种细胞于96孔培养板上，每孔接种量为100 μl，细胞密度为6×104/ml，加入不同浓度的As2O3共同温育，同时设定空白及阴性对照，分别于各时间点用MTT方法测定其抑制率。

　　抑制率(%)=[(OD阴性孔-OD给药孔)/OD阴性孔]×100%

　　VEGF mRNA表达的RT-PCR检测

　　按预设时间点收集未加药组(空白对照)及各给药组样本，调整细胞数2×106个，离心弃上清。严格按照试剂盒(RNAex Reagent & Systems上海华舜生物工程有限公司产品)步骤提取总RNA后，反转录合成cDNA，按RT-PCR试剂盒(TaKaRa RNA PCR Kit大连宝生物工程有限公司产品，批号：DRRO24A)对cDNA产物行PCR扩增，体系为： cDNA 2 μl，上、 下游引物各 0.5 μmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，dNTP 2 mmol/L，Taq 1 U/L，10×Buffer 2.5 μl，加灭菌三蒸馏水至25 μl。瞬时离心后置PCR扩增仪上：95℃ 2分钟预变性;95℃ 45秒，63℃ 45秒，72℃ 45秒，40 个循环;72℃延伸5分钟，结束反应。PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成，扩增VEGF的两种剪接变异体：VEGF121和VEGF165，扩增产物均为254 bp。

　　上游引物：5′-CCCTGATGAGATCGAGTACAT CTT-3′ ex3;下游引物：VEGF121：5′-GCCTCGGCT TGTCACATTTT-3′ ex5/8，VEGF165：5′-AGCAAGG CCCACAGGGATTT-3′ ex5/7;β-actin扩增产物为117 bp，P1：5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′ ;P2：5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′。

　　对特异性的扩增产物电泳后采用Gel Doc 1000紫外图象分析系统和配套分析软件(美国Bio-Rad公司)半定量分析其表达变化，测相对值，相对值= 灰度VEGF/灰度β-actin。

　　统计学分析

　　用统计软件包SPSS 10.0对实验结果进行统计处理，采用多重线性回归，双因素相关分析及方差分析。

　　结 果

　　As2O3对Raji细胞的增殖抑制作用

　　在1-50 μmol/L As2O3的浓度范围内，随药物浓度的增加及作用时间延长，Raji细胞的生长受到抑制(表1)。通过倒置相差显微镜观察发现：1 μmol/L的As2O3作用48小时时Raji细胞的形态改变不明显，仍可见分裂相;但8 μmol/L的As2O3作用48小时时多数细胞胞体变形，细胞周围有数个小泡状突起，核染色质浓缩边聚。以抑制率(inhibition rate，IR)为因变量，以浓度(dose)、时间(time)为自变量，建立回归方程：IR=0.531dose+0.481time(P<0.05)。Table 1. Inhibition effect of As2O3 on Raji cell at different concentrations for every time point (略)

　　As2O3对Raji细胞VEGF121、VEGF165 mRNA表达的影响

　　RT-PCR实验结果显示：Raji细胞同时表达VEGF121和VEGF165 mRNA，二者表达水平相当(VEGF121为1.17±0.14;VEGF165为1.31±0.19，P>0.05)，各试验浓度As2O3持续作用不同时间均可使Raji细胞VEGF121、VEGF165 mRNA的表达下调(表2、3)。统计学分析表明，VEGF121和VEGF165 mRNA的表达在各浓度组间无显著性差异(P>0.05)，但二者的下调变化与药物作用时间呈负相关关系：rsv121=-0.547，P<0.05;rsv165=-0.632，P<0.05。Table 2. VEGF121 level from Raji cells after exposure to As2O3 at different concentrations on the following time (略)Table 3. VEGF165 level from Raji cells after exposure to As2O3 at different concentrations on the following time (略)

　　讨论

　　Raji细胞是人B细胞淋巴瘤的建株细胞，本实验采用MTT法检测了As2O3对Raji细胞增殖的影响。结果显示，As2O3能明显抑制Raji细胞的增殖。8 μmol/L和1 μmol/L的As2O3在第24小时和第72小时对Raji细胞的抑制率分别是39.63%、100%和17.11%、30.11%，效应呈时间、剂量依赖性，建立回归方程：IR=0.531dose+0.481time(P<0.05)。国内、外同类研究显示：As2O3发挥抑制肿瘤细胞增殖的有效浓度，除了在NB4(APL建株细胞)细胞可低至0.1-2 μmol/L，对其它多数肿瘤细胞均在2-10 μmol/L水平，显示出剂量依赖性的增殖抑制效应。Zhu等[2]报道，1 μmol/L的As2O3仅轻度抑制Raji细胞的增殖，其机制主要是延长细胞周期时间。聂林等[3]对As2O3诱导淋巴瘤细胞凋亡的体外实验研究发现：4 μmol/L的As2O3作用Raji细胞48小时后Raji细胞凋亡率为40%左右。本实验结果与上述文献报道基本一致，4-8 μmol/L水平产生的显著的增殖抑制的原因，应该认为主要与凋亡机制有关。目前的研究提示，砷剂具有多方面的抗肿瘤作用，诱导凋亡是被多数研究所证实，而且是较肯定的机制之一，而有关其抗血管生成作用目前较肯定的是能诱导内皮细胞凋亡。但肿瘤血管新生的多环节、多步骤的协同发生提示我们：血管内皮生长因子、内皮细胞、细胞外基质等均是抗血管生成的重要靶点[4]。血管内皮生长因子(VEGF)是调节血管新生的中心环节，其异常高表达是大多数肿瘤的重要特征[5，6]。VEGF基因位于染色体6P21，3，经转录水平的剪切，可产生5个不同的转录子，VEGF121、145、165、189、206。它们各具不同的生化和生物学特性，其中VEGF121和VEGF165为分泌型细胞因子，具有直接诱导内皮细胞增殖的作用，占总VEGF的78%。VEGF165因比VEGF121多一段Exon7而具备与肝素及细胞外基质结合的能力，甚至多一些特异性的受体。因此研究者普遍认为VEGF165的活性高于VEGF121[7，8]。本实验通过RT-PCR半定量分析显示：Raji细胞同时表达VEGF121及VEGF165两种异构体，表达水平相当(VEGF121：1.17±0.14，VEGF165：1.31±0.19，P>0.05)。加入As2O3后，VEGF165及VEGF121 mRNA的表达均随药物作用时间的推移出现下调，二者均显示与作用时间呈负相关关系(rsv121=-0.547，P<0.05;rsv165=-0.632，P<0.05)。VEGF165对As2O3的作用相对敏感，24小时即出现表达下调，至48小时表达被进一步抑制;而VEGF121 mRNA的表达至药物作用48小时后才出现明显下调。该结果提示： As2O3抑制Raji细胞表达VEGF各异构体具有选择性，由于其对高活性的VEGF165的抑制作用更加明显，故而推测As2O3的抗血管生成活性可能较高。此外，对MTT和RT-PCR两部分实验联合分析剂量-效应关系还发现：1 μmol/L的As2O3对Raji细胞的增殖抑制效应弱，持续作用72小时方达30%左右的抑制率;而1 μmol/L的As2O3对VEGF mRNA的表达却可通过时间的积累产生显著的下调效应，这提示As2O3在低浓度水平即可有效下调VEGF mRNA的表达。目前，实时定量RT-PCR方法因其能准确定量而渐被广泛应用，但设计合适的引物及探针存在一定难度，且国内、外文献尚未见用该法检测VEGF mRNA各剪切异构体表达的报道，因此，本研究半定量RT-PCR的结果将为后续准备开展的QRT-PCR提供可靠的实验依据。

　　总之，As2O3对Raji细胞作用表现有多方面，既可抑制细胞增殖又能下调其VEGF mRNA表达。鉴于这种多面性进一步的研究需探寻一个能在多环节发挥协同作用的最低有效剂量，且上述体外实验的结果也需在后继的体内研究及临床实践中更全面的证实。目前，肿瘤的治疗更强调一种多渠道、多信号通路阻断的综合治疗模式，As2O3多环节的作用机制也许正适合该治疗模式的需要。因此，我们推测As2O3有可能成为一种更为有效的新的淋巴瘤联合化疗方案的药物。

　　【参考文献】

　　1 李丽，张日，朱子玲. 三氧化二砷下调慢性髓系白血病骨髓细胞VEGF的表达. 中国实验血液学杂志，2003;11：263-265

　　2 Zhu XH，Shen YL，Jing YK，et al. Apoptosis and growth inhibition in malignant lymphocytes after treatment with arsenic trioxide at clinically achievable concentrations. J Nat Cancer Inst，1999; 91: 772-778

　　3 聂林，张恒. 三氧化二砷对恶性淋巴瘤细胞株凋亡的研究. 肿瘤，2001; 21：79-81

　　4 李新刚. 血管内皮细胞生长因子内—自分泌环在恶性血液病发病中的意义. 国外医学•输血及血液血分册，2003; 26：210-213

　　5 邢丽华. Endoglin与肿瘤血管生成及在肿瘤研究中的意义. 国外医学•肿瘤分册，2003; 30：184-186

　　6 List AF. Vascular endothelial growth factor signaling pathway as an emerging target in hematologic malignancies. Oncologist，2001; 6(Suppl 5): 24-31

　　7 Neufeld G，Cohen T，Gengrinovitch S，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J，1999; 13: 9-22

　　8 Masood R，Cai J，Zheng T，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an autocrine growth factor for VEGF receptor-positive human tumors. Blood，2001; 98: 1904-1913.