bcr-abl基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响

　　作者：姜扬文,钱莉,蒋桂花,刘伟,龚卫娟,季明　　作者单位：扬州大学附属医院血液内科，扬州 225001;1扬州大学医学院免疫学教研室，扬州 225001;基金项目：本研究为江苏省自然科学基金(编号BK2004404)

　　【摘要】为了研究bcr-abl融合基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响，采用pVbcr-abl 、pVbcr-abl/mIL7两种质粒分别免疫BALB/c小鼠，然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击免疫小鼠，观察疫苗对SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的影响，检验其是否具有免疫保护作用。结果表明：用基因疫苗免疫的两个实验组与两个对照组(空白对照组和空载体对照组)相比，在移植肿瘤形成时间、肿瘤表面破溃时间、肿瘤体积、荷瘤生存期等指标上均存在明显差异。pVbcr-abl/mIL7免疫小鼠组的荷瘤生存时间比pVbcr-abl免疫组相对延长。常规病理学分析发现，对照组小鼠的移植瘤组织比较致密，瘤细胞体积较大，形状不规则，而两个免疫组的肿瘤组织较为疏松，肿瘤细胞体积相对较小，并有大量炎性细胞浸润。两个对照组小鼠的肝脏组织内发现有大量肿瘤转移灶，而两个免疫组小鼠则未发现。结论： 接受 bcr-abl 基因疫苗免疫的小鼠被诱导产生较强的特异性免疫保护力，对 SP2/0/bcr-abl 移植瘤的体内生长有一定抑制能力。

　　【关键词】 慢性粒细胞白血病,bcr-abl融合基因,基因疫苗;SP2/0/bcr-abl移植瘤

　　Abstract To study the influence of vaccine of bcr-abl fusion gene fragment on inoculated SP2/0/bcr-abl tumor cells in mice，BALB/c mice were immunized with pVbcr-abl，pVbcr-abl/mIL7 plasmids，respectively，then SP2/0/bcr-abl cells expressing the fragment of bcr-abl fusion gene were inoculated subcutaneously into the groin of BALB/c mice in order to observe the effect of vaccine on growth of inoculated SP2/0/bcr-abl tumor cells. The results showed that there were distinct differences on the time of tumor growth，the time of tumor ulceration，tumor volume and survival time of mice bearing tumor between two immunized groups and two control groups (blank and vacant plasmid groups). The mice immunized with pVbcr-abl/mIL7 lived longer as compared to mice immunized with pVbcr-abl. The tissue of inoculated tumor was more compact，tumor organ was larger，tumor form was irregular in 2 control groups，while the tissue of inoculated tumor was looser，tumor volume was smaller，and with mass inflammatory infiltration in two immunized groups. Moreover， the metastatic tumor cells were found in the livers of control groups，but not observed in two immunized groups. It is concluded that the protection occured in immunized mice which inhibited the growth of SP2/0/bcr-abl tumor cell in vivo.

　　Key words chronic myeloid leukemia;bcr-abl fusion gene;gene vaccine;SP2/0/bcr-abl tumor

　　Bcr-Abl融合蛋白存在于90%以上的CML患者体内，它与恶性转变及恶性克隆的维持密切相关。本研究小组曾采用含bcr-abl融合基因片段的重组反转录病毒感染小鼠SP2/0细胞系(H-2d)，获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的细胞株——SP2/0/bcr-abl，为我们检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定了物质基础[1]。在本研究中我们首先分别采用pVbcr-abl 、pVbcr-abl/mIL7两种质粒免疫BALB/c小鼠，用上述表达bcr-abl融合基因片段的、具有相同遗传背景的鼠传代肿瘤细胞攻击基因疫苗免疫的小鼠，观察CML基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的影响。

　　材料和方法

　　细胞和实验动物

　　SP2/0/bcr-abl细胞株由本室构建，采用含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液，于5 % CO2、37 ℃条件下培养。清洁级6周龄雌性BALB/c小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。动物生产许可证：SCXK(苏)2002-0009，使用许可证：SCXK(苏)2002-0045。将40只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成4组：pVITRO2-mcs空载体对照组、pVbcr-abl载体免疫组、pVbcr-abl /mIL7双表达载体免疫组、空白对照组。

　　质粒和质粒PEI复合物

　　质粒pVITRO2-mcs购自Invivogen公司。pVbcr-abl、pVbcr-abl/mIL7由本室构建。质粒的扩增纯化参见文献[2]。取0.5 mg (0.25 ml)纯化重组质粒与 1 mg(0.5 ml)PEI 混合后轻微振荡，室温放置15分钟，形成质粒PEI复合物。PEI(25 kD) 购自Sigma公司。

　　免疫小鼠

　　取上述质粒PEI复合物，每2周免疫1次小鼠，共计4次。每次免疫前，预先给小鼠股四头肌注射蔗糖(0.25 毫克/只)，24小时后在相同部位注射质粒100微克/只。

　　种植SP2/0/bcr-abl肿瘤细胞

　　第4次基因免疫后20天，取对数生长期SP2/0/bcr-abl细胞，按2×106个细胞/小鼠的数量，接种在小鼠的腹股沟皮下。

　　肿瘤生长的监测

　　观察小鼠荷瘤时间、测量肿瘤体积变化和小鼠存活情况。按公式V=1/6πab2计算肿瘤相对体积[2]，式中a为小鼠皮下移植瘤的最长径、b为垂直径。

　　常规病理学检查

　　对荷瘤小鼠进行常规病理学检查，取肝、脾、肾、肺、脑及肿瘤组织，以10%中性福尔马林溶液固定48小时以上，石蜡切片，HE染色，镜检。

　　统计学处理

　　采用SAS软件对实验数据作随机记数资料方差分析，并进行两两比较。小鼠生存率评估用SPSS 8.0软件包Kaplan-Meier检验进行分析。

　　结果

　　免疫小鼠的移植瘤出现时间和表面破溃时间延迟

　　用pVbcr-abl 、pVbcr-abl/mIL7两种质粒免疫BALB/c小鼠后，应用表达bcr-abl融合基因片段的鼠传代细胞SP2/0/bcr-abl细胞攻击基因疫苗免疫的小鼠。通过对4组接种肿瘤细胞后的小鼠进行监控，记录小鼠移植肿瘤开始生长的时间及出现肿瘤破溃的时间。结果发现未注射疫苗和注射空载体的小鼠从第6-7天出现移植瘤，14天左右出现肿瘤破溃，而2个注射疫苗组的小鼠从第11-13天才触及移植瘤的生长，延续到21天左右才出现肿瘤的破溃(图1)。2个疫苗免疫组与2个对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而pVbcr-abl免疫组与pVbcr-abl/mIL7免疫组之间无显著性差异(P>0.05)。这一结果提示，用pVbcr-abl与pVbcr-abl/mIL7质粒免疫小鼠能够在一定程度上抑制移植肿瘤细胞的生长。

　　小鼠移植瘤生长速率受到抑制

　　定期测定荷瘤鼠皮下移植瘤最长径(a)及垂直径(b)，计算肿瘤相对体积，绘制小鼠移植瘤体积变化曲线。结果显示，pVbcr-abl免疫组和pVbcr-abl/mIL7免疫组与两个对照组比较，均有显著性差异(P<0.05)，但pVbcr-abl/mIL7免疫组与pVbcr-abl免疫组比较则无显著性差异(P>0.05)(图2)。这表明经pVbcr-abl、pVbcr-abl/mIL7质粒免疫的小鼠对移植肿瘤的抵抗力较强，可以在一定程度上抑制肿瘤的生长速度。

　　荷瘤小鼠的生存期延长

　　pVbcr-abl和pVbcr-abl/mIL7基因疫苗免疫小鼠后，用相同遗传背景的SP2/0/bcr-abl细胞攻击，比较小鼠接种SP2/0/bcr-abl肿瘤细胞后的死亡情况，结果如图3所示。预先用2种基因疫苗免疫的小鼠，尤其是pVbcr-abl/mIL7免疫组的生存期明显延长，与2个对照组相比有显著性差异(P<0.01)，而2种基因疫苗免疫组之间比较无显著性差异(P>0.05)。

　　常规病理学观察分析

　　肉眼可以发现2个对照组小鼠的肿瘤组织血管丰富，肿瘤组织呈现浸润性生长趋势，空白对照组小鼠的肝脏上出现许多白色小点(图4)。HE染色的瘤组织切片如图5所示，2 个对照组小鼠的移植瘤组织比较致密，瘤细胞体积较大，形状不规则，而2个疫苗免疫组的肿瘤组织较为疏松，肿瘤细胞体积相对较小，并有大量炎性细胞浸润。2个对照组小鼠的肝脏组织切片中均发现大量瘤细胞转移灶(图6)。

　　讨 论

　　慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)具有特征性的bcr-abl融合基因。CML患者特征性bcr-abl融合基因蛋白的抗原性来自融合位点周围，这段氨基酸序列在正常细胞中不存在，因此该序列是肿瘤特异性抗原[3]。慢性粒细胞白血病的肿瘤特异性免疫治疗研究和基因治疗研究正日益受到人们的重视[4-6]。但是，目前国内外均缺少表达人bcr-abl融合基因的小鼠细胞实验模型，严重地限制了CML的免疫治疗研究和基因疫苗研究工作的深入开展。最近本组采用含bcr-abl融合基因片段的重组反转录病毒感染小鼠SP2/0细胞系(H-2d)，筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的细胞株，并经基因组整合和基因表达水平鉴定得到证实。SP2/0/bcr-abl肿瘤细胞系的建立，为我们构建CML实验动物模型和体外CTL实验提供了研究平台。

　　在本研究中，我们预先使用2种基因疫苗(pVbcr-abl 、pVbcr-abl/mIL7)分别免疫BALB/c小鼠(H-2d)，激活机体免疫系统，诱导特异性免疫保护能力，然后给每只小鼠按照 2×106 个细胞量，在腹股沟皮下接种相同遗传背景的(H-2d)SP2/0/bcr-abl细胞，成功地构建了可以在肿瘤细胞表面利用H-2d呈递bcr-abl融合基因蛋白抗原表位的小鼠荷瘤实验模型。实验发现，用bcr-abl基因疫苗免疫的小鼠，无论是使用单表达载体基因疫苗组，还是使用同时表达mIL-7的双表达载体基因疫苗组，与空白对照组和空载体对照组相比较，在肿瘤形成时间、肿瘤表面破溃时间、肿瘤体积、荷瘤生存期等指标上均存在明显差异。而pVbcr-abl/mIL7免疫小鼠组的荷瘤生存时间比pVbcr-abl免疫组相对延长。和两个实验组相比较，对照组小鼠的肿瘤组织表面血管更加丰富，呈浸润性生长趋势，并出现明显的肿瘤细胞肝脏转移。两个疫苗免疫组的小鼠移植肿瘤组织较为疏松，有大量炎性细胞浸润，以pVbcr-abl/mIL7免疫小鼠组尤为明显，2个实验组均未发现肿瘤细胞肝脏转移现象。所有这些结果都表明，2个bcr-abl基因疫苗免疫组的小鼠体内被诱导产生了较强的特异性免疫保护力，对SP2/0/bcr-abl移植瘤生长有一定抑制能力，其具体免疫保护机制有待进一步地深入研究。

　　【参考文献】

　　1 姜扬文，钱莉，刘伟等. 稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立. 中国实验血液学杂志，2005，13：1-4

　　2 姜扬文，季明春，钱莉等. 慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因克隆与真核细胞表达的研究.江苏医药，2003; 29: 899-901

　　3 Deininger MW，Goldman JM，Melo JV，et al. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood，2000; 96: 3343-3356

　　4 Schwartz J，Pinillba-Ibarz J，Yuan RR，et al. Novel targeted and immunotherapeutic strategies in chronic myeloid leukemia. Semin Hematol，2003; 40: 87-96

　　5 Cathcara K，Pinilla-Ibarz J，Korontsvit T，et al. A multivalent bcr-abl fusion peptide vaccination trial in patients with chronic myeloid leukemia. Blood，2004;103:1037-1042

　　6 Verfaillie CM，Mclvor RS，Zhao RC. Gene therapy for chronic myelogenous leukemia. Mol Med Today，1999; 5: 359-366.